吳慶華，史惠蓉，魯 寧，江 淼，趙振華，孔祥東

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心鄭州450052

#通訊作者，男，1969年8月生，博士，副教授，研究方向:單基因遺傳病的基因診斷，E-mail:kongxd@263.net

血友病B是X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，發(fā)病機(jī)制為凝血因子Ⅸ(factorⅨ，F(xiàn)9)基因突變導(dǎo)致血漿F9因子含量減少或功能缺陷。F9基因位于Xq27.1-27.2［1］，其突變可以發(fā)生在F9基因的任何位置。F9基因編碼產(chǎn)物包括454個(gè)氨基酸，是肝臟合成的維生素K依賴性凝血因子之一，在凝血途徑中起著重要的作用。該疾病尚無滿意的根治方案，目前臨床上仍以外源性的F9因子替代為主要方法，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。對血友病患者家族行攜帶者篩查和產(chǎn)前診斷是避免該出生缺陷最有效的方法。該研究采用對F9基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并擴(kuò)增后DNA直接測序的方法，對3個(gè)血友病B家系成員進(jìn)行了基因診斷、攜帶者篩查和胎兒的產(chǎn)前診斷。

1 對象與方法

1.1 家系資料 3個(gè)血友病B家系(圖1)來自于2010年5月至2011年5月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心遺傳咨詢門診，均有家族史，先證者已經(jīng)臨床確診為血友病B患者。

家系1已發(fā)現(xiàn)患者3例。先證者Ⅲ2，男，25歲，自2歲起，家人發(fā)現(xiàn)其皮膚破損處血流難以自止，遂檢測凝血功能，并確診為F9因子活性低下。先證者的表弟Ⅲ12、舅舅Ⅱ4也均檢測出F9因子活性低。先證者妹Ⅲ3妊娠18周時(shí)，來鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心要求行攜帶者篩查，并請求產(chǎn)前診斷。家系成員Ⅲ4、Ⅲ11有生育要求，要求行攜帶者篩查。

家系2先證者Ⅱ5，男，19歲，外院查F9因子活性低下，臨床表現(xiàn)為外傷后出血不止和反復(fù)性關(guān)節(jié)血腫，先證者及其母親Ⅰ2、姐姐Ⅱ2、Ⅱ3和Ⅱ4要求行基因診斷和攜帶者篩查。家系中的2位女性攜帶者于妊娠18周行產(chǎn)前診斷。

家系3家族中僅發(fā)現(xiàn)1名患者Ⅱ1，男，3歲，外院查F9因子活性低下，轉(zhuǎn)診至鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心要求進(jìn)一步檢查，其母在孕10周時(shí)來該中心行產(chǎn)前診斷。

來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心積累的健康無血緣關(guān)系個(gè)體的100個(gè)DNA樣本作為正常對照。該研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有基因診斷工作均取得患者及家屬的同意并簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本收集 ①抽取3個(gè)家系中先證者及其父母、要求行攜帶者篩查的家族女性成員外周靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝。②行產(chǎn)前診斷的4個(gè)孕婦分別于妊娠18周和10周，在無菌操作下采用羊膜腔或絨毛穿刺術(shù)抽取胎兒組織。采用北京天根試劑公司生產(chǎn)的DNA試劑盒提取DNA，操作步驟按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.3 PCR擴(kuò)增及DNA測序 PCR擴(kuò)增F9共8個(gè)外顯子及側(cè)翼序列的DNA，所用引物參照參考文獻(xiàn)［2］合成。反應(yīng)體系:50μg/L的模板DNA 2μL，500μmol/L的dNTP 2μL，上、下游引物各1μL，10×buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶2 U，純水16.5 μL，共25μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58～65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。用乙醇對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，采用ABIBigDye 3.1測序試劑盒，PCR反應(yīng)后純化，在ABI3130xl基因測序儀上對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行測序，用Chromas軟件將測序結(jié)果與正常序列進(jìn)行比對，尋找基因突變位點(diǎn)。

圖1 3個(gè)血友病B家系圖譜

1.4 突變驗(yàn)證 針對研究中發(fā)現(xiàn)的新突變，對100名健康無關(guān)男性個(gè)體行相應(yīng)的外顯子測序排除為多態(tài)性位點(diǎn)后被認(rèn)為是新突變。

1.5 胎兒組織母體污染排除和胎兒性別鑒定 對進(jìn)行產(chǎn)前診斷的羊水和絨毛標(biāo)本采用美國Promega公司的PowerPlex?16 HSSystem試劑盒和GeneMapper v3.2軟件以排除母體污染，同時(shí)確定胎兒性別。

2 結(jié)果

2.1 家系中患者和攜帶者直接測序分析結(jié)果 家系1中先證者Ⅲ2和家族內(nèi)另一患者Ⅲ12檢出10487G＞A突變，位于第4外顯子，導(dǎo)致GGA發(fā)生錯(cuò)義突變?yōu)锳GA，編碼氨基酸由79位的甘氨酸變?yōu)榫彼?G79R)。先證者Ⅲ2的母親Ⅱ1和家族女性成員Ⅲ3和Ⅲ11攜帶10487G＞A雜合突變，Ⅲ4未檢出突變，故Ⅲ3和Ⅲ11為血友病B攜帶者，Ⅲ4為非攜帶者(圖2)。

圖2 家系1中F9基因第4外顯子10487G＞A突變A:正常女性個(gè)體，為GG純合子;B:女性攜帶者為GA雜合突變;C:患者為AA純合突變;D:胎兒為正常個(gè)體。

家系2中，先證者Ⅱ5的F9基因檢測出17788DelG突變，該突變位于第5外顯子，先證者母親Ⅰ2存在相同位點(diǎn)雜合缺失突變。對該家系女性成員行攜帶者篩查示Ⅱ3、Ⅱ4存在雜合缺失突變，提示Ⅱ3、Ⅱ4為血友病B攜帶者，Ⅱ2無突變，為正常女性個(gè)體(圖3)。

圖3 家系2中F9基因第5外顯子17788DelG突變A:正常女性個(gè)體;B:女性攜帶者為17788DelG雜合缺失突變; C:患者為17788DelG純合缺失;D:胎兒為正常個(gè)體。

家系3中，先證者的F9基因第2內(nèi)含子5’端剪切位點(diǎn)處檢出IVS2+4A＞T(c.6493A＞T)突變，其母Ⅰ2在相同位點(diǎn)檢出A/T的雜合突變，其父未檢出突變(圖4)。

2.2 新突變驗(yàn)證 為鑒別17788DelG為突變或多態(tài)，對100名健康無關(guān)個(gè)體行第5外顯子測序，均未發(fā)現(xiàn)攜帶有該突變，排除了17788DelG為多態(tài)的可能性。

2.3 產(chǎn)前診斷結(jié)果 家系1和2中的3個(gè)胎兒均為男胎，未攜帶有同家系中先證者相同的基因突變，家系3為女性胎兒，攜帶有IVS2+4A＞T雜合突變，為血友病B致病基因攜帶者。

2.4 隨訪 4個(gè)行產(chǎn)前診斷的胎兒家庭經(jīng)遺傳咨詢后選擇繼續(xù)妊娠，在胎兒出生后取外周血行凝血因子檢測，確定4個(gè)新生兒血清 F9因子活性均正常。

圖4 家系3中F9基因第2外顯子IVS2+4A＞T(c.6493A＞T)突變A:正常女性個(gè)體;B:女性攜帶者為第2內(nèi)含子5’端A/T雜合突變;C:患者為TT純合突變;D:胎兒攜帶A/T雜合突變。

3 討論

臨床上最常見的血友病為血友病A和血友病B，其中，血友病B占15%～20%。男性患者表現(xiàn)為關(guān)節(jié)、肌肉和內(nèi)臟自發(fā)性出血、血腫或者外傷后出血不止，女性攜帶者無癥狀或癥狀輕微。F9基因是惟一發(fā)現(xiàn)與血友病B發(fā)生相關(guān)的基因。由于F9基因較小，現(xiàn)多采用全基因測序的方法對F9基因突變進(jìn)行研究，可以在99%以上的血友病B患者中檢出突變。研究［3］發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變是最常見的基因突變，約80%左右，其次為無義突變、剪切位點(diǎn)突變、小缺失或插入、啟動(dòng)子區(qū)突變。在一些血友病B家系中，還檢測到了 F9基因的雙突變和三位點(diǎn)突變發(fā)生［4］。

該研究通過DNA測序方法對F9基因的8個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列直接測序，檢測出了與3個(gè)家系中血友病B患者相關(guān)的F9基因突變位點(diǎn)。家系1中F9基因突變發(fā)生于第4外顯子，F(xiàn)9基因10487位發(fā)生了G→A的點(diǎn)突變，導(dǎo)致79位氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼幔撏蛔冊谘巡突變數(shù)據(jù)庫中已有報(bào)道。外顯子4編碼F9的類表皮生長因子1 (EGF1)結(jié)構(gòu)區(qū)，EGF1區(qū)中含有一鈣離子結(jié)合位點(diǎn)［5］，對于EGF區(qū)和γ羧基谷氨酸(Gla)結(jié)構(gòu)區(qū)間形成正確的分子構(gòu)象具有重要的作用，EGF1區(qū)結(jié)構(gòu)的完整性是F9具有完整生物學(xué)活性所必需的，該區(qū)的核苷酸突變可以直接影響F9的生物學(xué)活性。

家系2中，F(xiàn)9基因突變位于第5外顯子，其編碼類表皮生長因子2結(jié)構(gòu)域(EGF2)，由于先證者F9基因17788位發(fā)生G堿基缺失突變，導(dǎo)致隨后表達(dá)的氨基酸出現(xiàn)移碼突變。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)和最新的數(shù)據(jù)庫，未見有該突變報(bào)道。

家系3中的患者在第2內(nèi)含子5’端第四位堿基處由正常的A突變?yōu)門，形成新的剪切位點(diǎn)，影響細(xì)胞內(nèi)前體mRNA的剪切，導(dǎo)致翻譯后的肽鏈中氨基酸序列發(fā)生改變，或生成短截的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，該突變在印度人群中已有報(bào)道［6］。

基因測序技術(shù)尚未普及之前，連鎖分析是最常用于血友病家族女性攜帶者篩查、產(chǎn)前基因診斷的方法，但采用的F9基因外多態(tài)性位點(diǎn)的同源重組現(xiàn)象可能使連鎖分析出現(xiàn)錯(cuò)誤?，F(xiàn)在直接突變分析已取代了連鎖分析方法，較既往使用連鎖分析診斷時(shí)間大大縮短，且能夠確定基因突變的位置，結(jié)果直接、精確。在先證者基因診斷明確的前體下，該研究采用DNA測序技術(shù)對可疑攜帶者和女性攜帶者的胎兒進(jìn)行了基因診斷，明確了家系1中Ⅲ3的胎兒未攜帶有G79R突變，家系2中女性攜帶者Ⅱ3和Ⅱ4的胎兒未攜帶同先證者相同的17788DelG突變，提示均為正常胎兒。家系3中的先證者母親妊娠的女性胎兒攜帶有IVS2+4A＞T雜合突變。4個(gè)行產(chǎn)前診斷的新生兒出生后取外周血檢測F9活性，確定均非血友病B患者，提示應(yīng)用DNA直接測序是對血友病B家系行產(chǎn)前診斷的快速準(zhǔn)確的方法。

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