葉志強， 張榮凱， 陳郁鮮， 戴海濤， 馮 輝， 杜庚衡， 曾 花， 曾 春△

(中山大學附屬第三醫(yī)院1急診科，2骨科，廣東廣州510630;3中山大學附屬第五醫(yī)院骨科，廣東珠海519000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種在老年人群中最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，骨關(guān)節(jié)炎的病理改變通常涉及整個關(guān)節(jié)，包括滑膜、軟骨及軟骨下骨，最終導致關(guān)節(jié)軟骨破壞和軟骨下骨贅形成，整個關(guān)節(jié)發(fā)生重塑。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一存在的一種細胞，研究表明關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的軟骨細胞發(fā)生凋亡，是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中軟骨退化的關(guān)鍵事件［1］。早在1998年，Hashimoto等［2］用流式細胞術(shù)檢測到骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)中軟骨細胞有22.3%發(fā)生凋亡，而正常人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡率僅為4.8%。2000年，Heraud等［3］采用TUNEL和Annexin－V標記的方法檢測到髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者中有18%～21%軟骨細胞發(fā)生凋亡，而正常對照關(guān)節(jié)軟骨中只檢測到2%～5%軟骨細胞發(fā)生凋亡。以上結(jié)果表明骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡是廣泛存在的。因此，闡明骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中軟骨細胞凋亡發(fā)生的機制，發(fā)現(xiàn)介導軟骨細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，對于確立骨關(guān)節(jié)炎的新防治靶點有重要意義。本研究采用白細胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)誘導軟骨細胞凋亡的骨關(guān)節(jié)炎細胞模型，闡述了轉(zhuǎn)錄因子早期生長反應(yīng)蛋白1(early growth response protein 1，Egr－1)在軟骨細胞凋亡中的作用。

材料和方法

1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine RNAi MAX、Hoechst 33258等購自Invitrogen;細胞6孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板購自 Corning;Egr－1抗體 CST 4153、caspase－3抗體CST9664、3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體CST2118均購自Cell Signaling Technology;ECL試劑盒購自廣州永諾生物科技有限公司;膠原酶D購自Sigma;體外重組小鼠IL－1β純蛋白購自R＆D公司;定量RT－PCR(quantitative RT－PCR，qRT－PCR)引物購自上海英駿生物技術(shù)有限公司，具體序列為:Egr－1正向5'－TATGAGCACCTGACCACAGAG－3'，反向5'－GCTGGGATAACTCGTCTCCA－3';GAPDH正向 5'－TTGTCATGGGAGTGAACGAGA－3'，反向5'－CAGGCAGTTGGTGGTACAGG－3'。Egr－1 siRNA片段序列為:si－Egr－1: 5'－GGACAAGAAAGCAGACAAA－3'，si－Egr－2:5'－GATGAACGCAAGAGGCATA－3'，對照序列為:5'－AAUCGCAUAGCGUAUGCCG－3'，均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的體外培養(yǎng) 將新生小鼠麻醉后處死，手術(shù)分離股骨頸、股骨髁和脛骨平臺，3 g/L膠原酶D 37℃消化45 min，回收軟骨片后置于0.5 g/L膠原酶D溶液中，37℃消化過夜?；厥辗蛛x的細胞懸液，用完全DMEM培養(yǎng)基將細胞密度稀釋至4×107/L，種植在6孔板中，培養(yǎng)6～7 d后，細胞逐漸融合。

2.2 流式細胞術(shù)檢測軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達用胰酶將貼壁培養(yǎng)的原代軟骨細胞消化成單細胞懸液，2%甲醛固定，90%冰乙醇打孔，Ⅱ型膠原抗體室溫染色1 h，Alexa 488Ⅱ抗室溫染色30 min，PBS清洗后用流式細胞儀檢測Ⅱ型膠原的表達情況。

2.3 Western blotting 將軟骨細胞種植在6孔培養(yǎng)板，至細胞融合度約80%，用IL－1β處理細胞，100 μL裂解液裂解細胞，收集細胞裂解液至1.5 mL EP管，超聲3次打斷基因組DNA，采用Bradford方法進行蛋白定量，煮沸樣本5 min，冰上冷卻后10 000×g離心30 s，取上清進行SDS－PAGE，然后100 V轉(zhuǎn)膜1 h，0.5%(W/V)脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，4℃Ⅰ抗孵育過夜，0.1%(V/V)TBST洗膜2次后，室溫孵育Ⅱ抗1 h，洗膜3次后即用ECL顯色曝光。

2.4 qRT－PCR 采用Trizol提取軟骨細胞RNA，Q－PCR反應(yīng)使用SsoFast EvaGreen Supermix在Bio－Rad IQ5上完成，每個反應(yīng)重復3次。PCR反應(yīng)條件:95℃初始變性，5 min后擴增40個循環(huán):95℃30 s，95℃1 min，72℃ 1 min。擴增完成后，觀察溶解曲線以判斷信號的特異性。以GAPDH擴增信號作為內(nèi)參照。mRNA相對表達量使用公式2－ΔCt計算(ΔCt=ΔCtEgr－1－CtGAPDH)。

2.5 RNA干擾 將軟骨細胞種植在6孔板中，至細胞融合度約60%時準備進行轉(zhuǎn)染，每個孔siRNA片段的量為200 pmol，按照Lipofectamine RNAiMAX的說明書進行操作。轉(zhuǎn)染24 h后用IL－1β純蛋白處理細胞。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié)果

1 原代軟骨細胞純度的鑒定

正常軟骨細胞組成性表達Ⅱ型膠原，為了檢測原代軟骨細胞的純度，我們將體外分離培養(yǎng)的軟骨細胞固定破膜后，用Ⅱ型膠原特異性標記軟骨細胞，采用流式細胞儀檢測軟骨細胞的純度，結(jié)果表明，軟骨細胞的純度較高，可以用于凋亡研究，見圖1。

Figure 1.The purity of chondrocyte determined by flow cytometry.圖1 流式細胞術(shù)檢測軟骨細胞的純度

2 IL－1β誘導軟骨細胞凋亡

如圖2A所示，細胞發(fā)生凋亡后呈現(xiàn)典型的核固縮形態(tài)，對凋亡的細胞進行了計數(shù)和統(tǒng)計(圖2B)后發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，IL－1β處理軟骨細胞4 h后凋亡率有輕微增加，但兩組之間無顯著差異，8 h和12 h后凋亡的發(fā)生率分別約為22%和43%，統(tǒng)計分析顯示與對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義，IL－1β呈時間依賴性地誘導軟骨細胞凋亡。激活型caspase－3是細胞凋亡的公認指標，因此我們還用 Western blotting檢測了caspase－3的表達變化，隨著IL－1β處理時間增加，激活型caspase－3發(fā)生時間依賴的表達上調(diào)，見圖2C。結(jié)果表明，IL－1β能誘導軟骨細胞發(fā)生典型的凋亡。

Figure 2.IL－1β induced apoptosis of chondrocytes.A:Hoechst 33258 staining of apoptotic chondrocytes(×200).B:quantitation of the results in A.At least 700 cells were counted in each group.C:IL－1β up－regulated the expression of cleaved caspase－3.±s.n=3.*P＜0.05 vs control.圖2 IL－1β誘導軟骨細胞凋亡

3 IL－1β誘導軟骨細胞凋亡中Egr－1表達上調(diào)

圖3A顯示伴隨著細胞凋亡的發(fā)生，Egr－1 mRNA在2 h有輕微上調(diào)，4 h及8 h發(fā)生顯著上調(diào)。圖3B顯示Egr－1蛋白在4 h及8 h有顯著上調(diào)，早于軟骨細胞發(fā)生顯著凋亡的時間(8 h)。以上結(jié)果表明，IL－1β在誘導軟骨細胞凋亡的同時，也誘導了轉(zhuǎn)錄因子Egr－1 mRNA及蛋白的表達上調(diào)。

4 siRNA干擾IL－1β誘導的Egr－1表達上調(diào)

2個Egr－1 siRNA片段均有效抑制了IL－1β誘導的Egr－1 mRNA及蛋白質(zhì)表達上調(diào)，見圖4。

5 干擾Egr－1表達保護IL－1β誘導的軟骨細胞凋亡

圖5A、B顯示IL－1β處理軟骨細胞12 h后引起約40%細胞發(fā)生凋亡，而采用2個RNA片段有效干擾Egr－1的表達后細胞的凋亡率顯著降低，分別約為15%和12%，同時細胞凋亡的標志物激活型caspase－3的表達量也受到抑制，見圖5C。以上結(jié)果表明干擾Egr－1的表達對軟骨細胞有一定的保護作用，Egr－1參與了IL－1β誘導的體外培養(yǎng)軟骨細胞凋亡。

Figure 3.IL－1β induced the transcription－dependent up－regulation of Egr－1.±s.n=3.*P＜0.05 vs control.圖3 IL－1β誘導轉(zhuǎn)錄依賴性Egr－1上調(diào)

Figure 4.Effective knockdown of Egr－1 expression by siRNA.±s.n=3.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs scrambled.圖4 siRNA抑制Egr－1表達

討論

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率高，是目前世界上最常見的關(guān)節(jié)炎。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率與年齡密切相關(guān)，隨著年齡的增長，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率顯著上升［4］。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計結(jié)果表明:55歲以上人群中骨關(guān)節(jié)炎的患病率約為80%，而60歲以上的人群幾乎都患有不同程度的骨關(guān)節(jié)疾病。我國是一個人口大國，而且即將邁入老年化社會，因此，骨關(guān)節(jié)炎是不可回避的一個社會問題。由于目前的研究成果對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制缺乏從根本上的認識，因此在骨關(guān)節(jié)炎的治療手段上依然相當保守，在疾病發(fā)展的晚期，患者最終必須接受全關(guān)節(jié)置換。因此，從分子水平上闡明骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制，尋找骨關(guān)節(jié)炎治療的關(guān)鍵靶點，成為亟待解決的關(guān)鍵問題。

IL－1β是與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病密切相關(guān)的炎癥因子，通過IL－1β刺激軟骨細胞是廣泛被認可和應(yīng)用的一種骨關(guān)節(jié)炎細胞模型［5－6］，然而IL－1β誘導軟骨細胞凋亡的機制，目前尚不清楚。Egr－1是即刻早期基因家族中的一員，這個家族在受到外界刺激后能迅速被激活，而不依賴于任何新蛋白的合成，Egr－1的表達產(chǎn)物是一個轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控下游基因的表達從而引起細胞功能的改變，目前的研究發(fā)現(xiàn)至少有30多種基因的轉(zhuǎn)錄需要Egr－1參與，涉及細胞生長分化和凋亡、免疫刺激、炎性細胞趨化等多個方面［7］。Egr－1與細胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)［8］，目前的研究認為Egr－1主要通過3種方式發(fā)揮促細胞凋亡作用:(1)直接轉(zhuǎn)錄上調(diào)抑癌基因p53的表達［9］;(2)與促凋亡基因c－Jun直接相互作用并增強其促凋亡活性［10］;(3)直接轉(zhuǎn)錄激活PTEN［11］。

Figure 5.Knockdown of Egr－1 protected chondrocytes from apoptosis induced by IL－1β.A:Hoechst 33258 staining of apoptotic chondrocyte(×200).B:quantitation of the results in A.At least 700 cells were counted in each group;C:up－regulation of cleaved caspase－3 was inhibited after knockdown of Egr－1.±s.n=3.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs scrambled.圖5 干擾Egr－1表達保護IL－1β誘導的軟骨細胞凋亡

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)伴隨著軟骨細胞凋亡的發(fā)生，IL－1β能時間依賴性上調(diào)Egr－1的表達水平，而有效干擾Egr－1的表達后，軟骨細胞對IL－1β的促凋亡作用有抵抗，細胞凋亡率從40%下降到15%左右，表明Egr－1在軟骨細胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能是介導骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中的關(guān)鍵蛋白。但Egr－1促軟骨細胞凋亡的靶基因尚未明確，進一步闡明Egr－1通過何種機制發(fā)揮促軟骨細胞凋亡作用是我們下一步研究的重點。

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