呂淑霞，徐 彬， 于曉丹，金雪花，林 英

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽110866）

細(xì)胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）屬于李斯特氏菌屬（Listeria），是一種重要的人畜共患病原菌，由于其在自然界分布廣泛，極易通過污染食品傳播，感染人和動(dòng)物引起食源性李斯特菌病，使易感人群產(chǎn)生腹瀉發(fā)熱，嚴(yán)重的導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，死亡率高達(dá)20%～30%[1]。在北美平均每年有500人死于此病，因此美國(guó)和歐盟對(duì)此污染非常重視，對(duì)即食性食品檢出率要求為零。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且靈敏度低，多重PCR[2]、RTPCR等雖有較高的特異性和敏感性，但需要特殊的儀器設(shè)備，不適合在基層推廣。此外，在基因水平食源性病原菌檢測(cè)方面，死菌DNA的存在通常會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果高于樣品中活菌的實(shí)際含量。因此，建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法意義極為重要。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，簡(jiǎn)稱LAMP）是2000年開發(fā)的一種新的核酸擴(kuò)增方法，針對(duì)靶基因的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條LAMP特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）在恒溫條件（65 ℃左右）下保溫約60 min進(jìn)行擴(kuò)增[3]，僅需普通水浴鍋即可。疊氮溴化乙錠（ethidium bromide monoazide，EMA）作為一種DNA結(jié)合染料，能夠滲透到細(xì)胞壁（膜）不完整的菌體內(nèi)，在光激活的條件下，易形成氮賓化合物與DNA結(jié)合[4-5]，從而抑制死細(xì)胞DNA的擴(kuò)增，而對(duì)活細(xì)胞的DNA不起作用，可以有效避免在基因檢測(cè)中因死菌的存在而對(duì)樣品污染活菌的高估。已有EMA-LAMP技術(shù)成功用于其他病原菌檢測(cè)的報(bào)道[6-7]。作者在前人研究采用LAMP技術(shù)和建議用染料的基礎(chǔ)上，使用疊氮溴化乙錠成功提高檢測(cè)靈敏度，并且通過選擇EMA濃度避免了污染性，使檢測(cè)方法既快速又簡(jiǎn)易，且靈敏度高、特異性強(qiáng)，為食品安全該領(lǐng)域的檢測(cè)技術(shù)提出了新方法，適合于基層使用。

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 本研究共采用9株菌株，其中包括2株單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19111和ATCC19115（陽性菌株），7株非單增李斯特菌（陰性菌株），均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 EMA、betaine：美國(guó)Sigma公 司 ；dNTPs、DL2000 DNA Marker、LAMP 引 物 ：TAKARA寶生物（大連）工程有限公司；Lysozyme：寶泰克生物科技公司；Proteinase K：Roche公司；Bst DNA Polymerase，Large Fragment：New England Biolabs公司；電泳儀水平板電泳槽及附件JY600C：北京君意東方電用儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)UNIVERSAL HOODⅡ-S.N.76S/03822：Bio-Rad 公司；500 W 鹵鎢燈：沈陽藝沈器化玻站；立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-30KBS：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4：國(guó)華電器有限公司；移液槍：Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌的培養(yǎng)和處理 將單增李斯特菌ATCC19111接種于胰酪胨大豆酵母浸膏培養(yǎng)基（TSA-YE）中，過夜培養(yǎng)（37 ℃、160 r/min）。取 10 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液于10 000 r/min離心1 min。菌懸浮在10 mL 0.85%的生理鹽水中，10 000 r/min離心1 min。生理鹽水稀釋使菌濃度為2.0×108CFU/mL，菌懸液留作檢測(cè)用。

1.2.2 LAMP反應(yīng)引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的單增李斯特菌hly基因序列，利用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4進(jìn)行分析，在其保守序列中的六個(gè)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)了4條引物：外引物 hly-F3、hly-B3，內(nèi)引物 hly-FIP、hly-BIP。 內(nèi)引物hly-FIP由F1C通過TTTT連接物與F2相連而組成，內(nèi)引物hly-BIP為B1C通過TTTT連接物與B2相連而組成。引物委托TAKARA寶生物（大連）工程有限公司合成。引物設(shè)計(jì)原理見圖1，引物序列見表1。

圖1 LAMP引物設(shè)計(jì)原理Fig.1 Schematic representation of the primer design for EMA-LAMP assay

表1 LAMP引物序列Tab.1 Nucleotide sequence of primer sets designed for EMA-LAMP assay

1.2.3 模板DNA的提取 取菌濃度為2.0×108CFU/mL的菌懸液500 μL于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集菌體；向每管加入90 μL ddH2O 重懸，加入 6 μL Lysozyme（50 mg/mL），用槍頭混勻，37℃溫浴15 min；加入4 μL Proteinase K（20 mg/mL），振蕩數(shù)秒，置于58℃恒溫水浴鍋內(nèi)孵育45 min；接著95℃加熱8 min，使酶失活；12 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.2.4 LAMP反應(yīng)體系與產(chǎn)物檢測(cè) LAMP反應(yīng)總體積為 25 μL： 0.2 mmol/L 的 hly-F3 和 hly-B3，0.8 mmol/L 的 hly-FIP 和 hly-BIP，4mmol/L 的MgSO4，1 ×ThermoPol Reaction Buffer （20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L （NH4）2SO4、2 mmol/L MgSO4、0.1%Triton X-100，pH 8.8，25 ℃），1.6 mmol/L 的 dNTPs，1 mol/L 的 betaine，8 U Bst DNA Polymerase，2 μL 模板 DNA， 加 ddH2O 至 25 μL。輕彈混勻，63℃恒溫反應(yīng)1 h后，80℃滅活10 min。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，用ddH2O取代模板DNA，其它反應(yīng)條件不變。取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer混勻后點(diǎn)樣于1 g/dL瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）中，150 V電泳35 min后于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物是否呈階梯狀條帶。如果為陽性反應(yīng)，則產(chǎn)生典型的階梯狀條帶，如果為陰性反應(yīng)，則無條帶產(chǎn)生[8-9]。

1.2.5 熱處理殺死菌細(xì)胞 取0.85%的生理鹽水處理的500 μL菌懸液放于1.5 mL離心管中，95℃水浴8 min。待菌懸液冷卻至室溫，涂平板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以確保熱處理的菌被完全殺死。

1.2.6 EMA-LAMP檢測(cè)的特異性試驗(yàn) 用ddH2O溶解EMA，配制成1 mg/mL母液，用錫箔紙包裹置于-20℃?zhèn)溆?。EMA為致癌物質(zhì)，操作時(shí)注意安全。取20 μL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的EMA溶液分別加入含有500 μL菌濃度為2.0×108CFU/mL的單增李斯特菌ATCC19111和ATCC19115以及7株非單增李斯特菌的離心管中，混勻并于黑暗下室溫放置5 min，后放在冰上，每5分鐘補(bǔ)充一次冰，距500 W鹵鎢燈16 cm，曝光20 min。按照1.2.3方法提取DNA，作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性。

1.2.7 不同濃度EMA對(duì)死菌DNA的LAMP擴(kuò)增影響 分別向含有濃度為2.0×108CFU/mL的500 μL熱殺死菌懸液中加入濃度為0.1 mg/mL的EMA溶液，使 EMA 的終質(zhì)量濃度分別為 0、0.2、0.4、0.8、2.0、4.0、8.0、10 μg/mL， 混勻并于黑暗下室溫放置 5 min，后放在冰上，每5 min補(bǔ)充一次冰，防止溫度升高，距500 W鹵鎢燈16 cm，曝光25 min。按照1.2.3方法提取DNA，作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。

1.2.8 不同濃度EMA對(duì)活菌DNA的LAMP擴(kuò)增影響 分別向含有濃度為2.0×108CFU/mL的500 μL活菌懸液中加入1 mg/mL的EMA母液，使EMA終質(zhì)量濃度分別為0、2.0、4.0、8.0、10、20、40、80 μg/mL，混勻并于黑暗下室溫放置5 min，然后放在冰上，每5分鐘補(bǔ)充一次冰，距500 W鹵鎢燈16 cm，曝光25 min。按照1.2.3方法提取DNA，作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。

1.2.9 EMA曝光時(shí)間的優(yōu)化 取20 μL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的EMA溶液，分別加入含有500 μL菌濃度為2.0×108CFU/mL的活菌和熱殺死菌的離心管中，混勻并于黑暗下室溫放置5 min，然后放在冰上，每5分鐘補(bǔ)充一次冰，距500 W鹵鎢燈16 cm， 曝光時(shí)間分別為 0、1、5、10、15、20 min。 按照1.2.3方法提取DNA，作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。

1.2.10 EMA-LAMP檢測(cè)的靈敏度試驗(yàn) 取20 μL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的EMA溶液，分別加入含有500 μL 菌濃度依次為 2.0×107、2.0×106、2.0×105、2.0×104、2.0×103、2.0×102、2.0×101、2.0×100CFU/mL的活菌懸液的離心管中，混勻并于黑暗下室溫放置5 min，后放在冰上，每5分鐘補(bǔ)充一次冰，距500 W鹵鎢燈16 cm，曝光20 min。按照1.2.3方法提取DNA，作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，檢測(cè)其靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMA-LAMP檢測(cè)的特異性評(píng)價(jià)

EMA-LAMP方法檢測(cè)結(jié)果顯示，兩株單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌種均出現(xiàn)LAMP的特征性條帶，而7株非單增李斯特菌及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)LAMP條帶。上述結(jié)果表明，EMA-LAMP方法檢測(cè)單增李斯特菌具有很好的特異性，見圖2。

圖2 EMA-LAMP的特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Specificity of amplification results by EMA-LAMP

2.2 抑制死菌DNA的LAMP擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度

不同濃度EMA處理菌濃度為2.0×108CFU/mL的熱殺死的單增李斯特菌后，LAMP反應(yīng)可擴(kuò)增出特異性的階梯狀條帶，EMA質(zhì)量濃度在0.2～2 μg/mL內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶逐漸減弱；當(dāng)EMA質(zhì)量濃度大于等于4 μg/mL時(shí)，無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。因此抑制死菌DNA的LAMP擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度為 4 μg/mL，見圖 3。

圖3 不同質(zhì)量濃度EMA對(duì)死菌DNA的LAMP擴(kuò)增影響Fig.3 Effect of the differential concentration of EMA on the LAMP for DNA from heat killed bacterial cells

2.3 不抑制活菌DNA的LAMP擴(kuò)增的最大EMA質(zhì)量濃度

不同濃度EMA處理菌濃度為2.0×108CFU/mL的單增李斯特菌活菌細(xì)胞后，LAMP反應(yīng)都能擴(kuò)增出特異性的階梯狀條帶，EMA質(zhì)量濃度在2～10 μg/mL內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶幾乎無變化；EMA質(zhì)量濃度在10～40 μg/mL時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶逐漸減弱；但當(dāng)EMA質(zhì)量濃度大于等于80 μg/mL時(shí)，無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)；所以不抑制活菌DNA的LAMP擴(kuò)增的最大EMA質(zhì)量濃度為10 μg/mL，見圖4。因此作者采用質(zhì)量濃度為4 μg/mL的EMA檢測(cè)單增李斯特菌活菌細(xì)胞。

圖4 不同質(zhì)量濃度EMA對(duì)活菌DNA的LAMP擴(kuò)增的影響Fig.4 Effect of the differential concentration of EMA onthe LAMP for DNA from viable bacterial cells

2.4 EMA激活光解的最佳曝光時(shí)間

利用 4 μg/mL EMA處理 菌濃度為 2.0×108CFU/mL的單增李斯特菌活菌細(xì)胞，在500 W鹵鎢燈下曝光0～20 min，LAMP反應(yīng)均能夠擴(kuò)增出特異性的階梯狀條帶且條帶亮度幾乎無變化，所以EMA的曝光時(shí)間對(duì)活菌DNA LAMP擴(kuò)增無影響，見圖5。

圖5 EMA的曝光時(shí)間對(duì)活菌DNA LAMP擴(kuò)增的影響Fig.5 Effect of the light exposure time on achieving complete photolysis of free EMA in suspensions of viable bacterial cells

同樣，利用4 μg/mL EMA處理菌濃度為2.0×108CFU/mL的熱殺死的單增李斯特菌，在500 W鹵鎢燈下進(jìn)行曝光0～20 min，LAMP反應(yīng)能夠擴(kuò)增出特異性的階梯狀條帶；曝光時(shí)間在0～10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶逐漸減弱；當(dāng)曝光時(shí)間為15 min時(shí)，條帶明顯減弱；當(dāng)日落光時(shí)間為20 min時(shí)，沒有擴(kuò)增條帶。所以EMA激活光解的最佳曝光時(shí)間為20 min，見圖6。因此作者建立EMA-LAMP鑒別檢測(cè)單增李斯特菌死活菌細(xì)胞時(shí)，確定EMA曝光時(shí)間為20 min。

2.5 EMA-LAMP檢測(cè)的靈敏度評(píng)價(jià)

隨著活菌細(xì)胞數(shù)目的減少，LAMP的階梯狀條帶也逐漸減弱，到活菌濃度為2.0×100CFU/mL時(shí)，不再出現(xiàn)LAMP條帶，因此EMA-LAMP方法檢測(cè)活的單增李斯特菌的檢出限是20 CFU/mL，見圖7。

3 結(jié)語

本研究表明：抑制活菌LAMP擴(kuò)增的EMA質(zhì)量濃度要大于10 μg/mL，與Lee和Levin[10]研究的抑制活菌PCR擴(kuò)增的結(jié)果相符。抑制死菌LAMP擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度為4.0 μg/mL。Gu和Levin[11]研究的抑制類志賀單胞菌死菌細(xì)胞的最小EMA質(zhì)量濃度為 1.0 μg/mL，Lee 和 Levin[10]研究的抑制死菌PCR擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度為0.8 μg/mL，Wang和Levin[12]研究的抑制死菌PCR擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL。因此EMA-LAMP檢測(cè)某種食源性致病細(xì)菌死活細(xì)胞時(shí)，必須選擇最佳EMA質(zhì)量濃度。試驗(yàn)結(jié)果證明4.0 μg/mL足以抑制2.0×108CFU/mL死菌細(xì)胞的擴(kuò)增，而對(duì)活菌細(xì)胞的擴(kuò)增無影響。

圖6 EMA的曝光時(shí)間對(duì)死菌DNA LAMP擴(kuò)增的影響Fig.6 Effect of the light exposure time on activating the DNA-bound EMA and on achieving complete photolysis of free EMA in suspensions of heat killed bacterial cells

圖7 EMA-LAMP的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Sensitivity of amplification results by EMA-LAMP

利用EMA與LAMP檢測(cè)相結(jié)合的技術(shù)，不僅可以有效區(qū)分單增李斯特菌病原菌的死活細(xì)胞，而且檢測(cè)單增李斯特菌活菌細(xì)胞的靈敏度可達(dá)到20 CFU/mL。同時(shí)，EMA-LAMP法與 EMA-PCR法、EMA-實(shí)時(shí)熒光PCR等[13-15]相比，不需要使用PCR等昂貴、精密的儀器設(shè)備，避免了DNA的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間的溫度循環(huán)等步驟，反應(yīng)更迅速、操作更簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本更低，為單增李斯特菌的快速鑒別檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向，有望成為簡(jiǎn)易的常規(guī)檢測(cè)手段，尤其適用于基層檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

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