陳文強(qiáng) ，彭 浩 ，鄧百萬(wàn) ，解修超 ， 劉開(kāi)輝 ，丁小維 ，蘭阿峰

（1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中723001;2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001）

紅豆杉（Taxaceae），俗稱(chēng)紫杉、赤柏松，為紫杉科紫杉屬長(zhǎng)綠針葉喬木，起源于古老的第三紀(jì)、第四紀(jì)冰川時(shí)期，曾廣泛分布于北半球，現(xiàn)今其分布范圍大大縮小。20世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著抗癌新藥紫杉醇的開(kāi)發(fā)利用，紅豆杉原料供需矛盾日益突出，1999年我國(guó)將紅豆杉屬物種列入一級(jí)保護(hù)植物。目前，全世界共有11種，我國(guó)有5種，即東北紅豆杉（Taxus cuspidata）、中國(guó)紅 豆杉（Taxus chinensis）、南方紅豆杉（Taxus chinensis var.mairei）、云南紅豆杉（Taxus yunnanensis）、西藏紅豆杉（Taxus wallichiana）。從紅豆杉中提取的紫杉醇具有治療惡性腫瘤、防治移植動(dòng)脈硬化、抗瘢痕形成、抗血管生成、抗癌等作用[1-3]。由于紅豆杉中紫杉醇含量非常低，加之紅豆杉資源匱乏。因此，對(duì)紫杉醇的生產(chǎn)及其提高紫杉醇產(chǎn)量的研究有著重要的意義。

紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是僅存在于紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）和澳洲紅豆杉屬（Austrotaxus）植物中的一種四環(huán)二菇酞胺類(lèi)化合物[4-7]。它是一種新型的天然抗癌藥物，以其高效、獨(dú)特的抗癌機(jī)制受到了重視。但紅豆杉內(nèi)生真菌在正常生理?xiàng)l件下很難大量合成紫杉醇，藥源嚴(yán)重短缺，加之市場(chǎng)對(duì)紫杉醇需求的日益增加，僅靠從紅豆杉樹(shù)皮中直接提取已不能滿足需要，同時(shí)也對(duì)野生資源造成極大的破壞。因此，利用生物技術(shù)提高內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)紫杉醇是生產(chǎn)紫杉醇的有效途徑之一。

真菌發(fā)酵液中添加合成紫杉醇的前體物質(zhì)可提高產(chǎn)量。漿果赤霉素Ⅲ （BaccatinⅢ）、醋酸鹽（Acetate）、 苯基丙氨酸 （Phenylalanine）、 苯甲酸（Benzoic acid）和亮氨酸（Leucine）是紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)生紫杉醇的有效前體物質(zhì)，但是苯甲酸和亮氨酸不是合成紫杉醇的直接前體物質(zhì)，苯甲酸（0.01 mmol/L）是產(chǎn)生紫杉醇的最佳激活劑[8-10]，這說(shuō)明了紅豆杉與內(nèi)生真菌產(chǎn)生紫杉醇的途徑可能不同。

在真菌不同的發(fā)酵時(shí)期加入不同的糖類(lèi)，同樣可提高紫杉醇的產(chǎn)量。依據(jù)內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)條件，根據(jù)不同的真菌選擇合適的培養(yǎng)基，尋找最佳發(fā)酵條件。研究不同產(chǎn)紫杉醇真菌的生長(zhǎng)條件，以提高紫杉醇的產(chǎn)量已成為目前重要的研究?jī)?nèi)容。水楊酸是植物體內(nèi)普遍存在的一種酚類(lèi)物質(zhì)，作為植物抗病反應(yīng)的重要信號(hào)分子，被認(rèn)為是一種新的植物激素，可激活多種與抗病相關(guān)的植物防御機(jī)制[11-15]，涉及并參與植物過(guò)敏反應(yīng) （hypersensitive response，HR）和系統(tǒng)獲得抗性 （systemic acquire resistance，SAR）反應(yīng)，在植物的抗病反應(yīng)中起重要的作用。水楊酸在誘導(dǎo)子處理細(xì)胞以提高次生代謝物的研究中對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，一定程度上能夠提高紅豆杉細(xì)胞紫杉醇的產(chǎn)量[16-17]。目前，不同劑量的水楊酸（SA）在不同培養(yǎng)階段添加對(duì)中國(guó)紅豆杉內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)紫杉醇的影響尚無(wú)報(bào)道。因此，對(duì)秦巴山區(qū)中國(guó)紅豆杉（Taxus chinensis）內(nèi)生真菌在不同培養(yǎng)階段，添加水楊酸的時(shí)間和劑量進(jìn)行研究其代謝產(chǎn)紫杉醇的影響有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 中國(guó)紅豆杉內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)紫杉醇的菌株：陜西理工學(xué)院陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 固體斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，C6H12O615.0 g， 瓊 脂 20.0 g，H2O 1000.0 mL。

1.1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖30.0 g，蛋白胨10.0 g， MgSO47H2O 3.0 g，維生素 B110 mg，KH2PO45.0 g，H2O 1000.0 mL。

1.1.4 培養(yǎng)條件 以液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，乙醇為助溶劑，配制不同濃度的水楊酸母液，采用過(guò)濾除菌方式加入培養(yǎng)液中，使最終加入到340.0 mL培養(yǎng)液中的水楊酸質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L。

1.1.5 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)樣 購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度＞98.0%，批號(hào) 080309，規(guī)格 20.0 mg。

1.1.6 主要儀器與設(shè)備 ZHWY-B2112B型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LSB50L型立式圓形壓力蒸氣滅菌器：上海醫(yī)用核子儀器廠制造；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA；SHB-3型真空泵抽濾機(jī)：鄭州杜甫儀器廠；TB-214型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LRH-250-GS型人工氣候箱：廣東省醫(yī)療器械廠；HP-1100高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的活化 取冰箱中保存的原菌株，置于室溫2～4 h，然后轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)4～5 d使菌種活化。

1.2.2 內(nèi)生真菌菌絲干重的測(cè)定 將發(fā)酵液用真空泵抽濾，并用無(wú)菌水洗滌菌絲后置于烘箱中，40℃烘干至恒重、電子天平精密稱(chēng)重。

1.2.3 內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)曲線 將活化的菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（50.0 mL培養(yǎng)液/250 mL三角瓶）進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后，取5.0 mL液體種子菌轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基（340.0 mL培養(yǎng)液/500 mL三角瓶）中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為28℃、200 r/min，定期測(cè)定菌絲干重和紫杉醇質(zhì)量濃度，并繪制內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 水楊酸的過(guò)濾除菌 用聚丙烯材料制成的孔徑0.22 μm的水溶性微孔濾膜過(guò)濾[18]。

1.2.5 水楊酸添加試驗(yàn) 采用單因子試驗(yàn)，用5.0 mg/L的水楊酸分別在0 d、對(duì)數(shù)期初期、穩(wěn)定期初期加入培養(yǎng)液中，進(jìn)行最佳誘導(dǎo)時(shí)間試驗(yàn)。然后，分別將水楊酸以 0、5.0、15.0、25.0、35.0、45.0 mg/L 的質(zhì)量濃度在同一時(shí)期添加到培養(yǎng)液中，進(jìn)行最佳水楊酸添加質(zhì)量濃度試驗(yàn)。

1.2.6 紫杉醇提取與純化 取菌絲1.0 g均質(zhì)5 min后甲醇抽提，抽提液離心，收集上層液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干，加入等體積水和二氯甲烷抽提，棄水相，收集有機(jī)相，再次蒸干，所得粉末溶于少量甲醇中，上80～100目硅膠柱進(jìn)一步分離純化。將發(fā)酵液4 000 r/min離心，取上清液于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/10體積后，加入等體積的乙酸乙酯超聲振蕩萃取1 h，收集乙酸乙酯相，并于 50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入適量氯仿溶解洗滌固體物，并于70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再加入適量甲醇溶解，最后合并含紫杉醇的甲醇溶液。

1.2.7 紫杉醇的HPLC測(cè)定及SA影響的測(cè)定 色譜條件以甲醇-乙腈-純水（體積比 35∶32∶33）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm，進(jìn)樣量10 μL。色譜柱為美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)的pn799160D-554型 Spherisorb C18。

準(zhǔn)確稱(chēng)取25.0 mg紫杉醇標(biāo)品，用甲醇溶解并定容至25.0 mL，精密稱(chēng)取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg，甲醇定容至25.0 mL，得母液質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。將母液依次稀釋成質(zhì)量濃度梯度為0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL，吸取 10 μL 進(jìn)樣（n=4），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。 發(fā)酵液中紫杉醇含量的轉(zhuǎn)換公式：

其中：M為每升發(fā)酵液中紫杉醇的質(zhì)量濃度（μg/L）；M0為每毫升甲醇定容液中紫杉醇的質(zhì)量濃度（mg/L）；V1為用甲醇定容的容量瓶的大小 （mL）；V2為每瓶發(fā)酵液的總量（mL）。

在本實(shí)驗(yàn)中，V1值和V2值是定值，V1為 10.0 mL，V2為 34.0 mL。

最后將各試驗(yàn)組所得的紫杉醇質(zhì)量濃度與對(duì)照組進(jìn)行比較，可得出水楊酸對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇是否有影響，以及水楊酸的最佳添加時(shí)間及添加劑量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度下紫杉醇標(biāo)品峰面積的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依次吸取 10 μL 質(zhì)量濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的紫杉醇標(biāo)品溶液進(jìn)樣（n=4），得到其峰面積，見(jiàn)表1。并利用面積歸一法求得其回歸方程為S=1 684.4+27 604.999 9C （S代表峰面積，C代表質(zhì)量濃度），相關(guān)系數(shù)R=0.995。再利用紫杉醇質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換公式求得每升發(fā)酵液中紫杉醇的質(zhì)量濃度，見(jiàn)圖1。

在實(shí)驗(yàn)HPLC色譜條件下，得到紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC色譜圖，見(jiàn)圖2。其保留時(shí)間約為5.7 min。通過(guò)對(duì)紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析及其標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，可知紫杉醇的保留時(shí)間，并以此確定樣品中紫杉醇的質(zhì)量濃度。

圖1 紫杉醇標(biāo)品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of the reference Taxol

圖2 樣品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of extracts of the fungi

表1 不同濃度下標(biāo)品紫杉醇峰面積的測(cè)定Tab.1 Peak area of standard goods taxol under different concentrations

2.2 菌絲體及其產(chǎn)紫杉醇質(zhì)量的分析

為研究?jī)?nèi)生真菌菌絲體的生長(zhǎng)和產(chǎn)紫杉醇的情況，在一個(gè)月時(shí)間內(nèi)每隔2 d測(cè)一次紅豆杉內(nèi)生真菌菌絲體的質(zhì)量。同時(shí)，測(cè)定其紫杉醇質(zhì)量。由此繪出該菌種的生長(zhǎng)曲線，從中得出該菌種的延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰退期。

內(nèi)生真菌菌絲體生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲體質(zhì)量不斷增加，13 d時(shí)達(dá)最大值5.5 g，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間則菌絲體質(zhì)量開(kāi)始緩慢下降。因此，從圖3可以確定，1～4 d為內(nèi)生真菌的延滯期，5～12 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，平穩(wěn)期時(shí)間較短，為13～16 d，質(zhì)量保持在 5.4 g左右，衰退期為 17～28 d，菌絲體質(zhì)量大幅度降低。

圖3 內(nèi)生真菌菌絲體生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of endophytic fungi

內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇質(zhì)量濃度曲線見(jiàn)圖4。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)紫杉醇的質(zhì)量濃度不斷增加，且在12～18 d時(shí)增長(zhǎng)幅度較大，19 d時(shí)質(zhì)量濃度達(dá)最大值，為582.0 μg/L。其后隨培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的質(zhì)量濃度迅速下降。其下降的原因可能是紫杉醇的合成量小于分解量。紫杉醇是一種極不穩(wěn)定的物質(zhì)，自然狀況下就能分解，溫度和光照會(huì)加速其分解。

圖4 內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇質(zhì)量濃度曲線Fig.4 Taxol content curve of endophytic fungi

2.3 水楊酸（SA）添加時(shí)間對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及紫杉醇質(zhì)量濃度的影響

水楊酸（SA 5.0 mg/L）添加時(shí)間對(duì)內(nèi)生真菌菌絲體生長(zhǎng)及產(chǎn)紫杉醇質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖5，圖6。

圖5 SA添加時(shí)間對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of SA add time on growth of endophyte mycelium

圖6 SA添加時(shí)間對(duì)紫杉醇質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of SA add time on taxol content

結(jié)果表明，隨著內(nèi)生真菌培養(yǎng)時(shí)間和水楊酸同步添加時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)生真菌菌絲體的質(zhì)量不斷增加且較未添加水楊酸時(shí)快，在11 d時(shí)質(zhì)量達(dá)5.7 g。添加的水楊酸與內(nèi)生真菌細(xì)胞接觸面最大，影響范圍最廣，刺激作用最強(qiáng)。同時(shí)，紫杉醇含量在9～15 d時(shí)增長(zhǎng)幅度較大，此時(shí)菌絲體細(xì)胞對(duì)合成紫杉醇的各種酶和前體物的需求量也大，恰好水楊酸能夠刺激內(nèi)生真菌細(xì)胞，并增強(qiáng)與其次生代謝有關(guān)的酶和前體物，加入水楊酸剛好能滿足細(xì)胞的需求并合成大量次級(jí)代謝產(chǎn)物——紫杉醇。因此，內(nèi)生真菌菌絲體穩(wěn)定期的15 d為水楊酸的最佳添加時(shí)間。此時(shí)，內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)紫杉醇的質(zhì)量濃度為604.0 μg/L。

2.4 水楊酸（SA）添加質(zhì)量濃度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及產(chǎn)紫杉醇質(zhì)量濃度的影響

在內(nèi)生真菌菌絲體生長(zhǎng)穩(wěn)定期初期向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加 0、5.0、15.0、25.0、35.0、45.0 mg/L的水楊酸，28℃、200 r/min培養(yǎng)15 d，分別測(cè)定內(nèi)生真菌菌絲體及紫杉醇質(zhì)量濃度，見(jiàn)圖7、8。

圖7 SA添加質(zhì)量濃度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of SA in different concentrations on growth of endophyte mycelium

圖8 SA添加質(zhì)量濃度對(duì)紫杉醇質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effect of SA in different concentrations on Taxol content

圖7結(jié)果表明，隨著水楊酸添加質(zhì)量濃度的增加，內(nèi)生真菌菌絲質(zhì)量略呈緩慢下降趨勢(shì)，其原因有待進(jìn)一步研究。圖8結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度水楊酸在一定程度均能提高紫杉醇的質(zhì)量濃度，隨著水楊酸質(zhì)量濃度的不斷增大，內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的質(zhì)量濃度也逐步增大。當(dāng)水楊酸濃度為25.0 mg/L時(shí)，紫杉醇質(zhì)量濃度達(dá)到最大值890.0 μg/L；但當(dāng)水楊酸質(zhì)量濃度增至45.0 mg/L時(shí)，紫杉醇質(zhì)量濃度卻下降為695.0 μg/L。這表明水楊酸質(zhì)量濃度過(guò)低，不能充分誘導(dǎo)內(nèi)生真菌細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，提高與次生代謝物合成相關(guān)的酶的活性，從而影響紫杉醇質(zhì)量濃度的積累。但過(guò)高質(zhì)量濃度的水楊酸會(huì)嚴(yán)重影響內(nèi)生真菌菌絲體的生長(zhǎng)，反而使紫杉醇的質(zhì)量濃度下降。其中以25.0 mg/L水楊酸對(duì)紫杉醇合成的促進(jìn)效果最為明顯，紫杉醇質(zhì)量濃度達(dá)890.0 μg/L，是未添加水楊酸的1.8倍左右。

3 結(jié)語(yǔ)

水楊酸的主要作用是提高內(nèi)生真菌細(xì)胞內(nèi)次生代謝所需的各種關(guān)鍵酶或其前體物，從而增強(qiáng)其次生代謝水平，有利于次生代謝物的積累。紫杉醇是一種次生代謝物，真菌細(xì)胞在正常狀況下不會(huì)大量合成，通過(guò)水楊酸對(duì)真菌細(xì)胞的刺激作用，使真菌細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，提高與次生代謝物合成相關(guān)的酶的活性，從而促進(jìn)紫杉醇積累[13，19-21]。

不同質(zhì)量濃度的SA均可提高紫杉醇的質(zhì)量濃度，水楊酸質(zhì)量濃度過(guò)低對(duì)真菌細(xì)胞的刺激作用不明顯，但過(guò)高質(zhì)量濃度的水楊酸會(huì)嚴(yán)重影響內(nèi)生真菌菌絲體的生長(zhǎng)，反而使紫杉醇的質(zhì)量濃度下降。因而，需選擇最佳的水楊酸添加時(shí)間和添加劑量。作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，25.0 mg/L為SA的最佳添加質(zhì)量濃度，紫杉醇產(chǎn)量可達(dá)890.0 μg/L，是未添加SA的1.8倍左右。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在菌絲穩(wěn)定期初期15 d時(shí)為水楊酸的最佳添加時(shí)間，可最大限度提高內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)紫杉醇的質(zhì)量濃度。

水楊酸的單獨(dú)作用有時(shí)并不能有效地誘導(dǎo)內(nèi)生真菌的防御反應(yīng)，但可極大地增強(qiáng)其它誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效應(yīng)。因而，利用水楊酸和其它誘導(dǎo)子的協(xié)同作用提高內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)紫杉醇的質(zhì)量濃度有待進(jìn)一步研究。

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