余云龍，鄒 華，張 強，郝 女

（江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

微藻在無光照的情況下可以利用有機碳源進行異養(yǎng)生長[1]的能力可以被用來達到處理廢水的目的。有研究表明，異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的生物量遠大于自養(yǎng)時的生物量，異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻的比生長速率是自養(yǎng)時的2.13倍[2]。與傳統(tǒng)污水處理方法相比，利用藻類處理污水可以克服傳統(tǒng)污水處理方法引起的二次污染、潛在營養(yǎng)物質(zhì)丟失等弊端，同時能夠作為污水深度處理，有效且低成本地去除氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)。因此，研究利用微藻處理氮磷廢水受到廣泛重視[3-4]。

目前微藻處理廢水的研究，無論是從應(yīng)用方面[5-8]，如高效藻類塘，藻菌協(xié)同、藻菌固定化廢水處理技術(shù)等，還是從理論研究方面[9-11]，如COD、氮磷去除的機理、生長環(huán)境因素等均主要集中在光照條件下，對黑暗條件下微藻處理廢水卻少有研究。黑暗條件下，利用微藻的異養(yǎng)生長處理廢水，可避免光自養(yǎng)生長過程中光抑制或光限制等問題，由于不受光照條件限制，處理效果穩(wěn)定，運行費用低廉。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 普通小球藻 Chlorella Vuganis：購自中科院水生生物研究所（FACHB-1068）。

1.1.2 活性污泥 取自無錫市蘆村污水處理廠二沉池。

1.1.3 模擬養(yǎng)殖廢水 根據(jù)無錫市南洋農(nóng)畜業(yè)有限公司的養(yǎng)豬場沖洗廢水的水質(zhì)人工配制，COD約500 mg/L、TN 約 100 mg/L、TP 約 20 mg/L，具體成分見表1。

以上試劑溶于10 L水、調(diào)節(jié)pH至7即得模擬廢水。

1.2 測定方法

COD的測定：采用GB11914-89重鉻酸鹽法；TN的測定：采用GB 11894-89堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法；TP的測定：采用GB 11893-89鉬酸銨分光光度法。

MLSS的測定：取定量污泥用濾紙過濾，在103～105℃烘2 h至恒重，干燥器中冷卻至室溫后稱重；小球藻干重的測定：取0.45 μm的纖維濾膜過濾藻，103℃烘至恒重；總?cè)~綠素測定：采用乙醇提取比色法。

表1 模擬廢水成分表Tab.1 Ingredient of simulant wastewater

1.3 實驗方法

1.3.1 藻種培養(yǎng) 藻種培養(yǎng)采用BG-11培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為25℃、光照強度5 000 Lx、光暗周期12 h：12 h、每天振搖3～5次，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

另一方面，這也是保護我國金融衍生品市場安全的必要之舉。2006年8月28日，美國芝加哥商業(yè)交易所率先推出人民幣期貨和期權(quán)產(chǎn)品交易。一來讓將來赴美國后塵的我國處于競爭的不利地位，二來由于我國的監(jiān)管機關(guān)對于境外衍生產(chǎn)品市場沒有監(jiān)管權(quán)，人民幣期貨期權(quán)市場價格操縱行為的負面影響傳到國內(nèi)時，我國能采取的監(jiān)管措施是十分有限的。因此，我們必須加強與國際貨幣法制、國際銀行監(jiān)管法制、國際證券監(jiān)管法制、國際貿(mào)易法、國際投資發(fā)展的協(xié)調(diào)。

1.3.2 藻種與污泥的馴化 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻種按體積分數(shù)20%接種到廢水中進行馴化，馴化條件為25℃、光照強度5000 Lx、光暗周期12 h：12 h、每天振搖3～5次，使其適應(yīng)在廢水環(huán)境中生長。污泥接種至廢水中，曝氣20 h，靜置沉淀2 h，排出上清液后重新添加廢水曝氣，如此循環(huán)。

1.3.3 光暗條件下普通小球藻的廢水處理 取小球藻接種于滅菌模擬廢水，質(zhì)量濃度34 mg/L，光照（強度5 000 Lx）或黑暗培養(yǎng)，溫度為25℃。定時取樣測定水質(zhì)。做3個平行實驗，文中數(shù)據(jù)為3個平行實驗平均值。

1.3.4 黑暗條件下菌藻協(xié)同處理廢水 以黑暗靜置、黑暗搖床培養(yǎng)條件下對藻、菌、藻菌混合設(shè)置6組實驗組，分別編號 A1（藻靜）、A2（藻搖）、B1（菌靜）、B2（菌搖）、C1（藻菌靜）、C2（藻菌搖），溫度 25℃，搖床150 r/min。藻菌混合組中藻、菌質(zhì)量濃度均為34 mg/L；純藻與純泥組中藻和泥的質(zhì)量濃度也均為34 mg/L。其中，純藻組中加入滅菌離心活性污泥上清液為補償液，純泥組中加入滅菌離心藻液上清液為補償液，實驗階段每天對各實驗組進行水質(zhì)測定，以此探究黑暗條件下小球藻與活性污泥混合相對于藻、菌單獨處理廢水時的差異。做3個平行實驗，文中數(shù)據(jù)為3個平行實驗平均值。

1.3.5 黑暗條件下普通小球藻可持續(xù)廢水處理的研究 取小球藻接種于滅菌后的模擬廢水中，質(zhì)量濃度34 mg/L，于黑暗、25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4 d后將離心獲得藻重新接種到新的模擬廢水，如此重復(fù)，期間定時測定藻干重、總?cè)~綠素及COD、TN、TP。做3個平行實驗，文中數(shù)據(jù)為3個平行實驗平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 光暗條件下普通小球藻的廢水處理

由圖1、圖2可見，COD、TN、TP均在第一天有較大幅度的下降，這是因為開始時營養(yǎng)物質(zhì)豐富，小球藻得以快速生長，吸收各營養(yǎng)物質(zhì)，之后則隨著藻數(shù)量上升以及營養(yǎng)物質(zhì)不足的限制，生長趨緩，最后基本穩(wěn)定。

圖1 光/暗條件下小球藻廢水處理COD變化曲線Fig.1 COD variation curves of Chlorella vuganis under light and dark condition

圖2 光/暗條件下小球藻廢水處理TN、TP變化曲線Fig.2 TN &TP variation curves of Chlorella vuganis under light and dark condition

從最后各指標的終值可見，黑暗條件下普通小球藻對COD的去除效果強于光照條件，而氮磷的去除則是光照條件強于黑暗條件。小球藻在光照及黑暗條件下分別進行自養(yǎng)及異養(yǎng)生長，對營養(yǎng)物質(zhì)有著不同的利用途徑及機理。有研究表明，某些微藻具有特殊的運送系統(tǒng)，可主動吸收培養(yǎng)基中的有機化合物。黑暗條件下，小球藻生長所必須的碳源主要來自廢水，通過吸收利用以維持自身的生長。而光照條件下，小球藻進行光合作用，碳源主要為CO2，因此在黑暗條件下小球藻對COD的去除強于光照條件。光照條件下，藻類通過光合作用把污水中 NH4+，NO3-、NO2-、H2PO4-等無機離子和尿素等有機物質(zhì)所含有的N、P等元素締合到碳骨架上，形成藻類細胞，以此達到對廢水中營養(yǎng)元素的去除；而黑暗條件下，藻僅通過上述的某些特殊通道對營養(yǎng)元素進行吸收，故在氮磷營養(yǎng)物質(zhì)的去除方面，光照條件較黑暗條件有更好的效果。

2.2 黑暗條件下菌藻協(xié)同處理廢水

圖 3為 4 d后各組 COD、TN、TP的去除率比較?？梢?，A1、A2對COD去除率分別為71.14%、52.59%，對TN去除率分別為76.58%和50.82%，對TP去除率為58.82%、49.44%?？梢姾诎禇l件下，靜置的環(huán)境更利于小球藻對廢水中COD及氮磷的吸收。實驗發(fā)現(xiàn)，A2較A1的pH值有較大波動，但均穩(wěn)定在7～8之間，因此可排除pH值為主要影響因素，考慮溶解氧的影響。

圖3 各實驗組去除效果Fig.3 Removal efficiency of each group

Gladue對微藻的異養(yǎng)生長總結(jié)了3個必需條件，其中一個就是細胞膜具通透性。有機物只有通過細胞膜進入細胞內(nèi)部，才能被藻類吸收利用，如果存在通透性障礙，必然限制藻類對有機物的利用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，影響細胞膜通透性的因素很多，比如溶解氧，較高的氧濃度可能導(dǎo)致細胞體內(nèi)活性氧積累而對細胞產(chǎn)生毒性，由此導(dǎo)致細胞膜通透性的下降[14]，影響了微藻的異養(yǎng)生長。因此，搖床條件其溶解氧較高，普通小球藻對營養(yǎng)物質(zhì)去除效果不佳。

A1、B1、C1對 COD 去除率分別為 71.14%、53.69%、77.70%，對TN的去除率分別為76.58%、56.07%、85.77%，對 TP去除率分別為 58.82%、46.66%、58.24%?？梢姡诤诎?、靜置條件下，COD及氮磷的去除，普通小球藻占主導(dǎo)地位。因為靜置條件下廢水中的溶氧有限，抑制了活性污泥的活性，藻菌兩者在碳、氮、磷等能源物質(zhì)有限的條件下存在競爭作用，因而在利于藻生長的條件下，藻菌混合體系藻的生長占優(yōu)勢，其對COD及氮磷的吸收占主導(dǎo)。

A2、B2、C2對 COD的去除率分別為 52.59%、98.62%、99.28%，對 TN去除率分別為 50.82%、82.43%、80.74%，對TP去除率分別為 49.44%、56.64%、55.05%?？梢姡诤诎?、搖床條件下，藻菌混合體系中COD及氮磷的去除主要依靠活性污泥。原因同上。

從A1與C1、B2與C2對各指標的去除效果來看，黑暗條件下，藻菌兩者的混合相比于純藻、純菌對COD、TN、TP的去除效果沒有顯著提升。因此，利用藻菌互利共生提升廢水處理效果的高效藻類塘在黑暗條件下其強化作用并不會發(fā)生。藻類在高效藻類塘中的大量繁殖，其作為一種生物載體不僅為細菌提供了大量的附著環(huán)境，而且藻類的光合作用也為細菌提供了充足的溶解氧，保證了好氧細菌的生長環(huán)境；細菌在藻類提供的友好環(huán)境中大量繁殖，其呼吸作用也為藻類提供了充足的碳源——二氧化碳，使高效藻類塘內(nèi)形成了更緊密的藻菌共生系統(tǒng)[15]。在黑暗條件下，藻并不產(chǎn)生氧，也不吸收細菌釋放的二氧化碳，因此其不具有類似高效藻類塘的互利共生作用；除此之外，藻類和細菌兩者在同一環(huán)境下亦存在拮抗和競爭作用。Mayo等人發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)菌在有小球藻存在的介質(zhì)中生長要比沒有小球藻的介質(zhì)中慢得多[16]，Oswald同樣也發(fā)現(xiàn)細菌對藻類生長的限制作用，在滅菌的廢水中小球藻生長迅速，產(chǎn)量較高[17]。因此，在黑暗條件下，藻菌混合并不會使其去除效果有顯著提升。

2.3 黑暗條件下普通小球藻的持續(xù)生長研究

黑暗條件下藻類可以異養(yǎng)生長，但是長期無光照對藻類的生長、生理是否存在不利影響，對微藻處理廢水效果有何種影響，關(guān)系到微藻異養(yǎng)處理廢水的實際可行性。作者連續(xù)實驗了4個周期，每個周期培養(yǎng)4 d，考察了小球藻生長和廢水處理的情況。

圖4、圖5為第一批次及第四批次小球藻黑暗條件下生長過程中總?cè)~綠素和藻干重變化曲線。從兩個圖可以看出，兩個批次的小球藻不管是總?cè)~綠素和藻干重的變化趨勢還是兩者的量都基本一致，第一天后小球藻快速生長，進入對數(shù)生長期，藻干重與葉綠素都有顯著增長，之后由于藻的數(shù)量及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的限制趨于穩(wěn)定。由此可見，3個批次的培養(yǎng)后小球藻依然能夠正常生長，而且并未出現(xiàn)葉綠素量減少或藻生長量下降的情況。

圖4 第一批次小球藻總?cè)~綠素和藻干重變化曲線Fig.4 Total chlorophyll&dry weight variation curve of the 1st batch Chlorella vuganis

圖5 第四批次小球藻總?cè)~綠素和藻干重變化曲線Fig.5 Total chlorophyll&dry weight variation curve of the 4th batch Chlorella vuganis

黑暗條件對藻類最大的影響在于葉綠素的合成，但有研究表明，某些藻類具有在黑暗條件下合成葉綠素的能力。原葉綠素酸酯（protochlorophyllide）是葉綠素合成途徑中關(guān)鍵的中間產(chǎn)物。在原葉綠素酸酯還原為葉綠素酸酯這一關(guān)鍵步驟，即D環(huán)的還原，有兩條途徑，即依賴于光的合成途徑（光反應(yīng)）和不依賴于光的合成途徑（暗反應(yīng)）[18]，已知有兩種酶催化原葉綠素酸酯D環(huán)雙鍵的還原進而形成葉綠素a的直接前體葉綠素酸酯a[19-20]。一個是依賴于光的原葉綠素酸酯氧化還原酶（light -dependent NADPH -protochlorophyllide oxidoreduetase，POR，EC 1.3.1.33）[21]， 另一個酶是不依賴于光的（暗反應(yīng)）原葉綠素酸酯還原酶（lightindependent protochlorophyllide oxidoreductase，LIPOR），這種酶不需要光就能催化原葉綠素酸酯的還原。藍細菌、藻類和裸子植物（非開花植物）同時具有這兩種酶。由于葉綠素?zé)o光合成酶的存在，光合細菌、藻類、裸子植物等都能在無光條件下合成菌綠素和葉綠素。而且近年來通過分子生物學(xué)手段分析各種能夠進行暗反應(yīng)的生物，包括細菌、藻類和植物，發(fā)現(xiàn)了與葉綠素的無光合成有關(guān)的基因位點[22]。閆海等的研究也表明，小球藻在有無光照條件下對其細胞色素合成的影響不大[23]。

圖6、圖7為黑暗條件下4個批次小球藻培養(yǎng)過程中COD、TN、TP的變化曲線。由圖可知，每個批次的COD與TN、TP一致，均在第一天內(nèi)大幅下降，說明小球藻已適應(yīng)該類廢水，無需長時間的調(diào)整適應(yīng)，之后各項指標逐步穩(wěn)定。4個批次COD去除率均保持在65%左右、TN為70%左右、TP50%左右，可見，黑暗條件下普通小球藻能夠持續(xù)生長且能對廢水進行長期處理。

圖6 4個批次小球藻廢水處理COD變化曲線Fig.6 COD variation curve of the 4 batches Chlorella vuganis

圖7 4個批次小球藻廢水處理TN、TP變化曲線Fig.7 TN&TP variation curve of the 4 batches Chlorella vuganis

3 結(jié)語

1）相比于光照條件，黑暗條件下普通小球藻對COD的去除更強，但其氮磷去除效果不如光照條件。而且，普通小球藻在黑暗環(huán)境下，靜置的條件對廢水中COD及氮磷的去除相比于搖床有更好的效果。

2）在黑暗、搖床條件下的藻泥混合體系中，活性污泥對廢水中COD及氮磷的去除占主導(dǎo)作用。在黑暗、靜置的條件下，則是普通小球藻對廢水中COD及氮磷的去除占主導(dǎo)作用。而且，黑暗條件下，藻菌混合并不會出現(xiàn)兩者互利共生強化廢水處理的效果。

3）普通小球藻能夠在黑暗條件下長期生長，且在過程中能對廢水進行持續(xù)處理。

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