王 云 ，倪 曄 *，孫志浩 ，宋 剛 ，夏子義

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

20世紀(jì)80年代，丙酮丁醇發(fā)酵工業(yè)曾是僅次于乙醇發(fā)酵工業(yè)的第二大發(fā)酵產(chǎn)業(yè)。但由于石油工業(yè)的發(fā)展，發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇逐漸被淘汰。近年來(lái)，隨著石油資源的短缺，原油價(jià)格的波動(dòng)，發(fā)酵法生產(chǎn)新型生物燃料——丁醇得到廣泛的關(guān)注[1-2]。國(guó)內(nèi)生物丁醇的生產(chǎn)主要以玉米為原料，丁醇生產(chǎn)的原料成本占了總成本的75%，因此尋找價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的非糧原料發(fā)酵生產(chǎn)丁醇成為一種必然趨勢(shì)。

玉米秸稈是我國(guó)最為豐富的農(nóng)作物秸稈之一，玉米秸稈中含有大量的纖維素類(lèi)物質(zhì)，包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[3-4]。其中纖維素和半纖維素被降解為可發(fā)酵的戊糖和己糖[5]。國(guó)內(nèi)外以玉米秸稈為原料發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的報(bào)道表明，利用玉米秸稈生產(chǎn)丙酮丁醇是可行的。2006年，Qureshi等[6]以Clostridium acetobutylicum P260為實(shí)驗(yàn)菌種，玉米秸稈為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇，當(dāng)玉米秸稈水解液糖質(zhì)量濃度為60 g/L并添加5 g/L木糖或木聚糖分批發(fā)酵時(shí)，總?cè)軇?.60 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度和生產(chǎn)率分別為 0.20 g/（L·h）、0.41 g/g。 2009 年，王旭明等[7]利用Clostridium acetobutylicum CICC 8008為生產(chǎn)菌種，以NaOH預(yù)處理的玉米秸稈酶解液為發(fā)酵底物進(jìn)行丙酮丁醇的發(fā)酵，丁醇質(zhì)量濃度達(dá)到6.20 g/L。2010 年，Qureshi等[8]以 Clostridium beijerinckii P260為實(shí)驗(yàn)菌種，利用Ca（OH）2去毒處理后的玉米秸稈水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇，獲得26.27 g/L的總?cè)軇ū?8.00 g/L，乙醇3.77 g/L，丁醇 14.50 g/L），生產(chǎn)強(qiáng)度為 0.31 g/（L·h），生產(chǎn)率為 0.44 g/g。 2011年 ，Lin 等[9]以 Clostridium acetobutylicum CICC 8008為生產(chǎn)菌種，玉米秸稈水解液為底物，采用Plackett-Burman （P-B）和 Central Composite Design（CCD）法對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵獲得的最大丁醇產(chǎn)量為6.57 g/L。

連續(xù)發(fā)酵是指在發(fā)酵過(guò)程中以一定的速率添加新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)以相同的速率放出發(fā)酵液的培養(yǎng)方式。與其他發(fā)酵方式相比，它縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高了生產(chǎn)強(qiáng)度和設(shè)備利用率，便于自動(dòng)化控制[10]。

國(guó)外秸稈燃料丁醇的研究生產(chǎn)水平已經(jīng)達(dá)到甚至超過(guò)了糧食發(fā)酵水平，但國(guó)內(nèi)對(duì)其研究仍處于初步階段，溶劑生產(chǎn)水平較低。作者以Clostridium saccharobutylicum DSM 13864為發(fā)酵菌株，利用玉米秸稈水解液為碳源，通過(guò)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了最優(yōu)培養(yǎng)基配方，并進(jìn)行了3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)；同時(shí)考察了變溫發(fā)酵過(guò)程對(duì)溶劑積累的影響，進(jìn)行了變溫連續(xù)發(fā)酵的初步研究。作者首次進(jìn)行了秸稈丁醇的變溫連續(xù)發(fā)酵，為實(shí)現(xiàn)以廉價(jià)糖質(zhì)原料為底物連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的工業(yè)化提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌 種 Clostridium saccharobutylicum DSM13864：購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心（DSMZ）。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）種子培養(yǎng)基（RCM 培養(yǎng)基）：酵母膏 3 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，可溶性淀粉1 g/L，葡萄糖 5 g/L，半胱氨酸鹽酸鹽 0.5 g/L，NaCl 3 g/L，NaAC 3 g/L，刃天青 3 mg/L；pH 6.5，115 ℃ 滅菌 20 min。

2）TYA 培養(yǎng)基：葡萄糖 40 g/L，牛肉膏 2 g/L，酵母膏2 g/L，胰蛋白胨6 g/L，乙酸銨3 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L；pH 6.5，115℃滅菌 20 min。

3）初始發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米秸稈水解液（以總糖計(jì) ）56.16 g/L，CaCO33.2 g/L，（NH4）2SO42 g/L，K2HPO40.5 g/L，玉 米 漿 干 粉 10 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L；pH 6.0，115 ℃滅菌 20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米秸稈水解液的制備 秸稈（3 cm）于烘箱中60℃烘烤過(guò)夜，粉碎機(jī)粉碎過(guò)40目篩；70 g秸稈與1 L 1%NaOH溶液混勻，于滅菌鍋中120℃處理120 min。將處理后的秸稈水洗至中性，110℃烘干，粉碎機(jī)粉碎過(guò)40目篩，得堿預(yù)處理后的秸稈。稱取堿處理后玉米秸稈7 g加100 mL水，H2SO4調(diào)pH至4.8，按20 FPIU/g秸稈的量加入ZSL酸性纖維素酶 （購(gòu)自山東澤生生物科技有限公司），50℃100 r/min水解72 h，離心，上清液即為玉米秸稈水解液。

1.2.2 培養(yǎng)方法

1）種子培養(yǎng)：菌種孢子液按體積分?jǐn)?shù)1%轉(zhuǎn)接于RCM培養(yǎng)基中，于真空干燥器中37℃培養(yǎng)12～18 h。

2）搖瓶培養(yǎng)：按體積分?jǐn)?shù)8%將種子液接種于新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基（TYA培養(yǎng)基、正交優(yōu)化所得的最優(yōu)培養(yǎng)基）中，250 mL三角瓶裝液量為150 mL，37℃培養(yǎng)48 h。

3)3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：裝液量1.5 L，接種體積分?jǐn)?shù)8%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h，培養(yǎng)基為正交優(yōu)化所得最優(yōu)培養(yǎng)基。

4）3 L發(fā)酵罐變溫調(diào)控培養(yǎng)：初始溫度37℃；pH降至5.1時(shí)，下調(diào)溫度至33℃；pH升至5.3時(shí)，下調(diào)溫度至30℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h。其余同3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)。

5）變溫發(fā)酵過(guò)程調(diào)控培養(yǎng)：（A）恒溫37℃；（B）初始溫度37℃；pH降至5.1時(shí)，下調(diào)溫度至33℃；pH升至5.3時(shí)，下調(diào)溫度至30℃；（C）初始溫度37℃；pH降至5時(shí)，下調(diào)溫度至33℃；（D）初始溫度37℃；pH降至5時(shí)，下調(diào)溫度至30℃。500 mL裝液量300 mL，接種體積分?jǐn)?shù)8%，培養(yǎng)基同3 L發(fā)酵罐培養(yǎng) （培養(yǎng)基中玉米秸稈水解液糖質(zhì)量濃度為56.16 g/L，添加葡萄糖使總糖達(dá)60 g/L）。

6）變溫連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵罐5個(gè)，500 mL裝液量為300 mL，稀釋率0.1 h-1，培養(yǎng)基同3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)。發(fā)酵開(kāi)始時(shí)5個(gè)罐中均裝有300 mL新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)接種（接種體積分?jǐn)?shù)8%），均于37℃培養(yǎng)至pH降至5，開(kāi)始補(bǔ)料連續(xù)發(fā)酵，同時(shí)將后3個(gè)罐降至30℃下培養(yǎng)。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 菌體OD值測(cè)定 用1.8 g/dL稀鹽酸稀釋發(fā)酵液10倍（除去發(fā)酵液中的不溶物CaCO3），于分光光度計(jì)中測(cè)定660 nm下的吸光值，為菌體濃度。

1.3.2 糖含量測(cè)定 采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。色譜柱：Aminex HPX-87H 離子色譜柱 （300 mm×7.8 mm，9 μm； 美國(guó)Bio-Rad）；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器；流動(dòng)相：3 mmol/L 硫酸；流速：0.5 ml/min；柱溫：55 ℃。

1.3.3 溶劑及有機(jī)酸測(cè)定 溶劑 （丙酮、 乙醇、丁醇）和有機(jī)酸（乙酸、丁酸）的測(cè)定：采用氣相色譜法（GC）；色譜柱：PEG-2M 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.4 μm）；檢測(cè)器：FID；載氣：N2；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：90∶1；內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)為異丁醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 Clostridium saccharobutylicum DSM 13864對(duì)玉米秸稈水解液中糖類(lèi)的利用情況

秸稈水解液中主要含有葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，作者考察了Clostridium saccharobutylicum DSM 13864對(duì)這3種糖及由這3種糖復(fù)配而成的混合糖的利用情況，以預(yù)測(cè)該菌株以玉米秸稈水解液為底物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的情況。

由表1可以看出，C.saccharobutylicumDSM13864可以分別利用木糖、葡萄糖、阿拉伯糖（糖質(zhì)量濃度均為40 g/L）為底物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇，產(chǎn)生9.04、11.80、10.02 g/L總?cè)軇?，糖利用率分別達(dá)到80.84%，100%，100%。按照美國(guó)農(nóng)業(yè)部Qureshi課題組[8]水解所得玉米秸稈水解液中木糖、葡萄糖、阿拉伯糖的組成配置的混合糖 （木糖 15.6 g/L，葡萄糖22 g/L，阿拉伯糖2.4 g/L）也能被該菌利用，產(chǎn)生11.61 g/L總?cè)軇?，包括：丁?.42 g/L，丙酮2.81 g/L和乙醇0.38 g/L，糖利用率達(dá)100%。由此推測(cè)C.saccharobutylicum DSM 13864能夠較好的利用玉米秸稈水解液來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化

對(duì)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中主要成分：（NH4）2SO4、CaCO3、K2HPO4和玉米漿干粉，進(jìn)行了四因素三水平正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表2，以期獲得利用玉米秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的最優(yōu)培養(yǎng)基配比。根據(jù)表3中極差分析結(jié)果可知，影響丁醇積累的因素由主到次為：C>B>D>A，即玉米漿干粉＞CaCO3＞K2HPO4＞（NH4）2SO4。根據(jù)表中數(shù)據(jù)分析，培養(yǎng)基最優(yōu)配比為C3B1D2A1，即 玉 米 漿 干 粉 15 g/L，CaCO32.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L。由于該組合在正交表中并未出現(xiàn)，因此在最優(yōu)配比條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可得總?cè)軇?4.97 g/L，其中丁醇10.86 g/L，丙酮3.51 g/L，乙醇0.61 g/L。確定該組合為培養(yǎng)基的最優(yōu)配比。

表1 C.saccharobutylicum DSM 13864利用組成玉米秸稈水解液的主要糖類(lèi)及其混合糖發(fā)酵產(chǎn)溶劑Tab.1 Production of ABE from individual sugars （glucose，xylose，arabinose） and their mixed sugars present in corn stover hydrolyzate by C.saccharobutylicum DSM 13864

表2 優(yōu)化培養(yǎng)基配方的四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)方案Tab.2 Four factorsand three levelsoforthogonal experiment on fermentation medium

表3 優(yōu)化培養(yǎng)基配方的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal experiment on fermentation medium

2.3 3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

作者考察了C.saccharobutylicum DSM 13864以玉米秸稈水解液為底物，在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇過(guò)程中各參數(shù)（菌體生長(zhǎng)、溶劑積累、有機(jī)酸產(chǎn)生等）的變化情況。培養(yǎng)基為2.2優(yōu)化所得的最優(yōu)培養(yǎng)基。由圖1可知，發(fā)酵總時(shí)間為48 h，在40 h時(shí)發(fā)酵結(jié)束，總?cè)軇?6.1 g/L，其中丁醇10.59 g/L，丙酮 4.04 g/L，乙醇 1.46 g/L，發(fā)酵強(qiáng)度為0.40 g/（L·h），生產(chǎn)率為 0.33 g/g。 發(fā)酵 20 h 時(shí)溶劑開(kāi)始迅速積累，隨著溶劑的產(chǎn)生，有機(jī)酸（乙酸和丁酸）量減少，乙酸和丁酸轉(zhuǎn)化為乙醇和丁醇。發(fā)酵初始總糖質(zhì)量濃度為51.33 g/L（葡萄糖37.5 g/L，木糖12.67 g/L，阿拉伯糖1.16 g/L），隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄糖大量減少，阿拉伯糖于28 h耗盡，發(fā)酵末期殘留2.25 g/L的木糖，結(jié)合表 1中糖利用情況，說(shuō)明C.saccharobutylicum DSM 13864對(duì)木糖的代謝能力弱于葡萄糖和阿拉伯糖。

該發(fā)酵過(guò)程的初始pH為5.67，隨著發(fā)酵初期有機(jī)酸（乙酸、丁酸）的產(chǎn)生，12 h時(shí)pH降至最低值4.99，隨后發(fā)酵進(jìn)入溶劑產(chǎn)生階段，發(fā)酵液pH值逐漸升高，發(fā)酵末期（48 h）pH值為5.62。由于發(fā)酵液中添加了CaCO3作為緩沖物質(zhì)，發(fā)酵過(guò)程最低pH為4.99；而未添加CaCO3的實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵過(guò)程的pH可降至3.64，造成過(guò)酸環(huán)境不利于菌體生長(zhǎng)，因而引起溶劑產(chǎn)量的下降，表明CaCO3是利用糖質(zhì)原料進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵中一種重要的pH緩沖物質(zhì)。

圖1 C.saccharobutylicum DSM 13864利用玉米秸稈水解液在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)丁醇Fig.1 Production of butanol from corn stover hydrolyzate byC.saccharobutylicum DSM 13864in a3L bioreactor

2.4 3 L發(fā)酵罐變溫調(diào)控培養(yǎng)

中國(guó)科學(xué)院研究所顧陽(yáng)等[11]報(bào)道，在產(chǎn)溶劑階段下調(diào)發(fā)酵溫度，可以提高丁醇產(chǎn)物濃度。為了提高溶劑積累量，進(jìn)行了3 L發(fā)酵罐變溫調(diào)控培養(yǎng)（初始溫度37℃；pH降至5.10時(shí)，下調(diào)溫度至33℃；pH升至5.30時(shí)，下調(diào)溫度至30℃）。由圖 2可知，發(fā)酵進(jìn)行至60 h時(shí)結(jié)束，總?cè)軇?7.02 g/L，其中丁醇11.90 g/L，丙酮4.61 g/L，乙醇0.51 g/L，發(fā)酵強(qiáng)度為 0.28 g/（L·h），生產(chǎn)率為 0.35 g/g。 發(fā)酵初始總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.8 g/L（葡萄糖37.51 g/L，木糖10.39 g/L，阿拉伯糖 0.9 g/L），葡萄糖、木糖和阿拉伯糖分別于44、48、32 h時(shí)耗盡，糖利用率達(dá)100%。發(fā)酵過(guò)程初始pH為5.61，于24 h時(shí)下降至最低4.99，發(fā)酵末期（72 h）pH 值為 5.74。

與3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)相比，發(fā)酵產(chǎn)溶劑階段下調(diào)發(fā)酵溫度雖然延長(zhǎng)了發(fā)酵周期（延長(zhǎng)了20 h），降低了發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度，但是提高了溶劑積累量和糖的利用率。因此，發(fā)酵過(guò)程變溫調(diào)控可用于發(fā)酵強(qiáng)度比較高的連續(xù)發(fā)酵中，以提高溶劑積累量和糖利用率。

圖2 C.saccharobutylicum DSM 13864利用玉米秸稈水解液在3 L發(fā)酵罐中變溫調(diào)控發(fā)酵生產(chǎn)丁醇Fig.2 Production of butanol from corn stover hydrolyzate by C.saccharobutylicum DSM 13864 using temperature-shifting in a 3 L bioreactor

2.5 不同變溫調(diào)控方式對(duì)溶劑積累的影響

為了確定合適的溫度梯度，嘗試了幾種不同的變溫調(diào)控方式。使用T檢驗(yàn)對(duì)不同變溫調(diào)控方式下的溶劑積累量和殘?zhí)沁M(jìn)行顯著性分析：A方式 （對(duì)照）與B方式（初始溫度37℃；pH降至5.1時(shí)，下調(diào)溫度至33℃；pH升至5.3時(shí)，下調(diào)溫度至30℃）、C方式（初始溫度37℃；pH降至5時(shí)，下調(diào)溫度至33℃）、D方式（初始溫度37℃；pH降至5時(shí)，下調(diào)溫度至30℃），結(jié)果見(jiàn)圖3。表明存在極顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明低溫有利于溶劑的積累并提高糖利用率；B、C、D之間總?cè)軇┓e累量無(wú)明顯差異 （P＞0.05），但是B與C、D之間丁醇積累量存在顯著性差異（P＜0.01）。C方式和D方式能達(dá)到基本相同的提高丁醇積累的效果，總?cè)軇┯?7.01 g/L（其中丁醇12.01 g/L）分別提高至19.81 g/L（其中丁醇12.99 g/L）和19.98 g/L（其中丁醇13.03 g/L）。從節(jié)能方面考慮，可根據(jù)不同的季節(jié)選用C或D方式。低溫雖然有利于積累溶劑和提高糖利用率，但是降低溫度使細(xì)胞代謝減緩，延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，降低了生產(chǎn)強(qiáng)度。C方式和D方式的生產(chǎn)周期延長(zhǎng)為80 h，生產(chǎn)強(qiáng)度為 0.25 g/（L·h）。

圖3 不同變溫調(diào)控方式對(duì)C.saccharobutylicum DSM 13864溶劑積累的影響Fig.3 Effect of different temperature-shifting operation on batch ABE fermentation by C.saccharobutylicum DSM 13864

2.6 變溫連續(xù)發(fā)酵

連續(xù)發(fā)酵通過(guò)連續(xù)流加新鮮培養(yǎng)基并以相同的速率連續(xù)地排出發(fā)酵液而使菌體保持穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)狀態(tài)，從而提高產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量。連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇不僅可以減少溶劑對(duì)菌體的毒害作用，也可以縮短發(fā)酵菌種延遲期提高丁醇的產(chǎn)率[10]。作者采用下進(jìn)上出的五級(jí)連續(xù)發(fā)酵方式，由于丙酮丁醇發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量氣體（CO2和H2），在該方式下，氣體產(chǎn)生的壓力不僅可以使發(fā)酵液自發(fā)地連續(xù)不斷向后流動(dòng)，也可實(shí)現(xiàn)各罐中發(fā)酵液的攪拌混勻。在連續(xù)發(fā)酵過(guò)程的前17個(gè)小時(shí)，5個(gè)罐均處于37℃分批發(fā)酵，待各罐pH下降至5.00時(shí)，即發(fā)酵將進(jìn)入產(chǎn)溶劑階段，啟動(dòng)補(bǔ)料泵開(kāi)始稀釋率為0.1 h-1的連續(xù)發(fā)酵，同時(shí)將后3個(gè)罐移入30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)。從圖4看出，該發(fā)酵過(guò)程在前80小時(shí)經(jīng)歷了一個(gè)不穩(wěn)定階段，原因在于補(bǔ)入第一個(gè)罐中的新鮮培養(yǎng)基要經(jīng)過(guò)40 h才能到達(dá)末級(jí)罐中，即57 h后末級(jí)發(fā)酵罐才獲得補(bǔ)料，獲得補(bǔ)料后饑餓狀態(tài)的細(xì)胞迅速增殖，產(chǎn)酸量增加，產(chǎn)溶劑量較低。連續(xù)發(fā)酵過(guò)程在80 h左右進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)并持續(xù)至269 h，穩(wěn)定期平均總?cè)軇?2.28 g/L，其中丁醇8.50 g/L，丙酮 3.41 g/L，乙醇 0.37 g/L，發(fā)酵強(qiáng)度為1.23 g/(L·h)，是變溫分批發(fā)酵（D 方式）的 4.92倍；平均總酸為4.42 g/L，乙酸2.97 g/L，丁酸1.45 g/L。在65 h時(shí)總?cè)軇┻_(dá)最高，為15.29 g/L（其中丁醇10.82 g/L），發(fā)酵末級(jí)罐中的平均殘?zhí)菫?.33 g/L（木糖），說(shuō)明發(fā)酵仍未完全結(jié)束，該連續(xù)發(fā)酵工藝仍需優(yōu)化。與其他（表4）以糖質(zhì)原料為底物固定化細(xì)胞或細(xì)胞循環(huán)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇實(shí)驗(yàn)相比，本研究的總?cè)軇┝坑兴岣摺?/p>

圖4 C.saccharobutylicum DSM 13864利用玉米秸稈水解液在五級(jí)變溫連續(xù)發(fā)酵中末級(jí)罐的溶劑及有機(jī)酸的生產(chǎn)Fig.4 Time course of solvent and acids production from corn stover hydrolyzate in final stage of the fivestage temperature-shifting continuous fermentation by C.saccharobutylicum DSM 13864

表4 文獻(xiàn)報(bào)道的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的數(shù)據(jù)比較Tab.4 Comparison of parameters in reported ABE continuous fermentation and this study

3 結(jié)語(yǔ)

C.saccharobutylicum DSM 13864可較好地利用玉米秸稈水解液中的主要糖分——木糖、葡萄糖、阿拉伯糖以及由這3種糖復(fù)配而成的混合糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇。作者通過(guò)正交優(yōu)化的方法確定了以玉米秸稈水解液為底物的最優(yōu)培養(yǎng)基配比：CaCO32.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，玉米漿干粉 15 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L。 在該條件下進(jìn)行3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，40 h時(shí)發(fā)酵結(jié)束，總?cè)軇?6.1 g/L，其中丁醇10.59 g/L，丙酮4.04 g/L，乙醇1.46 g/L，發(fā)酵強(qiáng)度為 0.40 g/（L·h），生產(chǎn)率為 0.33 g/g。在產(chǎn)溶劑階段下調(diào)發(fā)酵溫度雖然會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期但可以提高溶劑量，降低殘?zhí)?。?duì)發(fā)酵強(qiáng)度較高的連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行變溫調(diào)控，稀釋率為0.1 h-1，80 h左右時(shí)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)并持續(xù)至269 h（11天），穩(wěn)定期平均總?cè)軇?2.28 g/L，其中丁醇8.50 g/L，丙酮 3.41 g/L，乙醇 0.37 g/L，發(fā)酵強(qiáng)度為 1.23 g/（L·h），是變溫分批發(fā)酵（D 方式）的4.92 倍。 作者對(duì)變溫連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，在工藝上仍需進(jìn)一步研究和改進(jìn)。以玉米秸稈水解液為底物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇，對(duì)于實(shí)現(xiàn)可再生資源的能源化具有重要的意義，為丙酮丁醇工業(yè)化生產(chǎn)工藝提供了參考。

[1]Qureshi N，Saha B C，Dien B，et al.Production of butanol （a biofuel） from agricultural residues：Part I-Use of barley straw hydrolysate[J].Biomass Bioenergy，2010，34：559-565.

[2]Qureshi N，Saha B C，Hector R E，et al.Butanol production from wheat straw by simultaneous saccharification and fermentation using Clostridium beijerinckii：Part I-batch fermentation[J].Biomass Bioenergy，2008，32：168-175.

[3]Kumar S，Kothari U，Kong L Z，et al.Hydrothermal pretreatment of switchgrass and corn stover for production of ethanol and carbon microspheres[J].Biomass Bioenergy，2011，35：956-968.

[4]LIN Z X，HUANG H，ZHANG H M，et al.Ball milling pretreatment of corn stover for enhancing the efficiency of enzymatic hydrolysis[J].Appl Biochem Biotechnol，2010，162：1872-1880.

[5]孫萬(wàn)里，陶文沂.木質(zhì)素與半纖維素對(duì)稻草秸稈酶解的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29（1）：18-22.SUN Wan-li，TAO Wen-yi.Effect of lignin and hemicellulose on enzymatic hydrolysis of cellulose from rice straw[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29（1）：18-22.（in Chinese）

[6]Qureshi N，Li XL，Hughes S，et al.Butanol production from corn fiber xylan using Clostridium acetobutylicum[J].Biotechnol Progr，2006，22（3）：673-680.

[7]王旭明，仇天雷，林有勝，等.酶水解液的丁醇發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（34）：17277-17280.WANG Xu-ming，QIU Tian-lei，LIN You-sheng，et al.Optimization of butanol production from corn straw hydrolysate by Clostridium acetobutylicum[J].Journal of Anhui Agri Sci，2009，37（34）：17277-17280.（in Chinese）

[8]Qureshi N，Saha B C，Hector R E，et al.Production of butanol （a biofuel） from agricultural residues：partⅡ-use of corn stover and switchgrass hydrolysates[J].Biomass Bioenergy，2010，34：566-571.

[9]LIN Y S，WANG J，WANG X M，et al.Optimization of butanol production from corn straw hydrolysate by Clostridium acetobutylicum using response surface method[J].Chin Sci Bull，2011，56（14）：1422-1428.

[10]王媛，范棟，陳有容，等.微生物發(fā)酵過(guò)程的多種培養(yǎng)技術(shù)[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009，21：122-125.WANG Yuan，F(xiàn)AN Dong，CHEN You-rong，et al.Multiple cultivation technologies of fermentation process of microbes[J].Biotechnol Bull，2009，21：122-125.（in Chinese）

[11]顧陽(yáng)，蔣宇，吳輝，等.生物丁醇制造技術(shù)現(xiàn)狀和展望[J].生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（7）：914-923.GU Yang，JIANG Yu，WU Hui，et al.Current status and prospects of biobutanol manufacturing technology[J].Chin J Biotech，2010，26（7）：914-923.（in Chinese）

[12]Qureshi N，Schripsema J，Lienhardt J，et al.Continuous solvent production by Clostridium beijerinckii BA101 immobilized by adsorption onto brick[J].World J Microbiol Biotechnol，2000，16：377-382.

[13]Lee S M，Cho M O，Park C H，et al.Continuous butanol production using suspended and immobilized Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 with supplementary butyrate[J].Energy Fuels，2008，22：3459-3464.

[14]Yen H W，Li R J.The effects of dilution rate and glucose concentration on continuous acetone-butanol-ethanol fermentation by Clostridium acetobutylicum immobilized on bricks[J].J Chem Technol Biotechnol，2011，86（11）：1349-1456.

[15]ZHANG Y D，MA Y J，YANG F X，et al.Continuous acetone-butanol-ethanol production by corn stalk immobilized cells[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36：1117-1121.

[16]Tashiro Y，Takeda K，Kobayashi G，et al.High production of acetone-butanol-ethanol with high cell density culture by cellrecycling and bleeding[J].J Biotechnol，2005，120（2）：197-206.