(中國科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071)

圍食膜(Peritrophic matrix,PM) 是無脊椎動物腸道內(nèi)包圍攝入食物的一種特殊結(jié)構(gòu),是由幾丁質(zhì)纖維網(wǎng)在黏附于其上的蛋白質(zhì)(圍食膜蛋白)相互作用下形成的半通透性膜狀結(jié)構(gòu)[1]。已發(fā)現(xiàn)的圍食膜有兩種類型,即I型和II型[2]。I型圍食膜是由中腸上皮細胞分泌并覆蓋于整個中腸表面;II型則由賁門附近的細胞分泌,隨著取食產(chǎn)生,包在食物表面并隨著消化廢物排出體外[3]。類似于脊椎動物消化道的黏液層,它是中腸上皮細胞和食物之間的一個物理屏障,可有效保護中腸細胞免受食物顆粒的損傷,促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,也是經(jīng)口進入發(fā)生感染的病原體防衛(wèi)前哨。由于圍食膜后即為敏感的腸道細胞表層,因此它被認(rèn)為是昆蟲等節(jié)肢動物最重要的腸道物理免疫屏障[3],在節(jié)肢動物先天性病毒免疫體系中具有重要地位[4]。

目前,與昆蟲同屬于節(jié)肢動物的對蝦,其圍食膜研究報道很少,只有對蝦近緣物種——銳脊單肢蝦(Sicyonia ingentis)腸道圍食膜的研究見諸報道[5]。近年來,病害每年都給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,尤其是對蝦白斑癥病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)[6]。通常情況下,在動物體攝食活動過程中,腸道是極易接觸病原的薄弱部位[7],對蝦腸道是最早可檢測到WSSV感染的組織之一[8-10]。由于通過消化道侵入的病毒必須穿過圍食膜屏障[3]。因此認(rèn)為,對蝦圍食膜必然在抵御病原侵染過程中發(fā)揮著重要的作用。

鑒于圍食膜具有重要的生理功能,在昆蟲害蟲防治中,以圍食膜為靶標(biāo)的生物防治技術(shù)已日漸興起。作者概述了昆蟲圍食膜的結(jié)構(gòu)及其功能,并對目前以昆蟲圍食膜為靶標(biāo)的害蟲生物防治技術(shù)進行了總結(jié),旨在通過逆向思維,借鑒昆蟲害蟲防治途徑,在本實驗室已經(jīng)獲得的中國對蝦圍食膜相關(guān)實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,探索新的以圍食膜保護為基本手段的對蝦WSSV病毒病防治新策略。

1 昆蟲圍食膜

1.1 昆蟲圍食膜結(jié)構(gòu)與圍食膜蛋白

昆蟲屬于節(jié)肢動物門,昆蟲綱(Insecta)。2001年Wang等[11]報道了第一個鱗翅目(Lepidoptera)圍食膜結(jié)構(gòu)的模型,它是幾丁質(zhì)-蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。在不同種類昆蟲中,圍食膜幾丁質(zhì)的含量有所不同,一般占圍食膜組分的 4%～20%[12]。圍食膜蛋白是圍食膜的主要組成成分,占圍食膜的20%～55%[7]。

根據(jù)從 PM 上提取的難易程度,圍食膜蛋白分為4類[7]：(1)在緩沖液條件下即可移除的;(2)用溫和的除垢劑如SDS等可被移除的;(3)用強的變性劑如尿素等才可移除的;(4)即使強的變性劑也很難移除的。其中第三類的圍食膜蛋白最多。昆蟲中圍食膜蛋白種類不盡一致,從幾種到幾十種的都有[13-14],同種昆蟲因發(fā)育時期,餌料營養(yǎng)等不同也可影響圍食膜蛋白的種類。

目前已鑒定的昆蟲圍食膜蛋白都是在強變性劑作用下,可從圍食膜上的幾丁質(zhì)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上解離的蛋白,統(tǒng)稱為圍食膜因子(Peritrophin)[7]。最早被報道的圍食膜蛋白是來自銅綠蠅(Lucilia cuprina)幼蟲的Peritrophin-44[15],以及來自粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的一種具有高度糖基化的腸道黏蛋白(Invertebrate Intestinal Mucins,IIM)[4]。它們都是幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白,具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Peritrophin Chitin Binding Domain,CBD)。這些CBD是圍食膜蛋白功能的核心。已發(fā)現(xiàn)的圍食膜蛋白具有數(shù)目不等的CBD,最多的有19個,最少的有1個[3]。根據(jù)氨基酸序列上保守半胱氨酸的排列組合不同,可將圍食膜因子分成A,B和C 3種類型。如圖1所示,A型圍食膜因子(Peritrophin-A)CBD內(nèi)的β折疊通過保守半胱氨酸的二硫鍵形成一個保護疏水殘基的口袋,并形成與幾丁質(zhì)結(jié)合的氫鍵。

圖1 昆蟲A型圍食膜因子 CBD的三維結(jié)構(gòu)示意圖(引自Hegedus,2009[16])

1.2 昆蟲圍食膜作為殺蟲劑的靶標(biāo)

圍食膜是昆蟲體內(nèi)的一道物理保護屏障,具有特殊結(jié)構(gòu)及重要的生理功能。昆蟲通過保持其完整性以保證營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,因此以圍食膜為靶標(biāo),如通過抑制其組分幾丁質(zhì)的合成或圍食膜中幾丁質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合,打破圍食膜正常的維持的生理機制,即可抑制昆蟲的生長發(fā)育,最終可以達到防治害蟲的目的。目前,化學(xué)農(nóng)藥殘留易使昆蟲產(chǎn)生耐藥性等副作用引起人們的關(guān)注,越來越多的國家開始重視生物防治的研究和應(yīng)用。研究表明大多數(shù)經(jīng)口感染的昆蟲病毒都是通過降解圍食膜侵入宿主[17],因此昆蟲對病毒的敏感度一定程度取決于腸道圍食膜的通透性。利用該原理,在病毒侵染過程中,輔助病毒沖破昆蟲圍食膜屏障的病毒基因已被應(yīng)用于病蟲害防控[18]。另發(fā)現(xiàn),將昆蟲病毒與低殘留化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合使用,使病毒首先通過破壞圍食膜,侵入宿主,影響宿主的正常生理狀態(tài),同時,在宿主體內(nèi)表達特定蛋白如磷酸酶/激酶等對農(nóng)藥特定靶蛋白受體進行調(diào)節(jié),使病害蟲對農(nóng)藥的敏感性增強,這樣即使減少農(nóng)藥的使用量,依然可以達到很高的殺蟲效果。目前,這種昆蟲病毒與低殘留化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配的殺蟲制劑已投入生產(chǎn)應(yīng)用[19]?？偟脕碚f,目前已知破壞圍食膜的成份與方式主要有以下幾種：

1.2.1 增強蛋白(enhancin)——降解圍食膜蛋白

增強蛋白最初是在桿狀病毒科(Baculoviridae)的顆粒體病毒屬(Granulovirus)中發(fā)現(xiàn)的[20],這種金屬蛋白酶所作用的底物是昆蟲中腸圍食膜的主要蛋白成分——腸道黏蛋白 IIM[4],它能降解 IIM,破壞宿主圍食膜,增加病毒與昆蟲中腸細胞接觸的機會,從而提高病毒感染昆蟲的幾率[17,21,22]。

1.2.2 幾丁質(zhì)酶(chitinase) ——降解圍食膜幾丁質(zhì)

幾丁質(zhì)酶存在于多種桿狀病毒,是一種具有生物催化活性的水解酶,可以降解昆蟲體內(nèi)的幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)酶能夠降解圍食膜中的幾丁質(zhì),引起圍食膜穿孔,嚴(yán)重時導(dǎo)致昆蟲消化道麻痹,停止攝食,最終饑餓而死。例如喂食重組表達幾丁質(zhì)酶蛋白的家蠶[23]和松墨天牛(Monochamus alternatus)[24],食物消耗率顯著減低,昆蟲體質(zhì)量明顯降低,死亡率提高。

1.2.3 熒光增白劑——破壞圍食膜蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合

Wang等[25]的研究發(fā)現(xiàn),熒光增白劑(Calcofluor)可以競爭性地結(jié)合到中腸新合成的幾丁質(zhì)上,從而阻斷圍食膜蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合,導(dǎo)致圍食膜結(jié)構(gòu)破壞,結(jié)果可使幼蟲發(fā)育遲緩,增加幼蟲對細菌病毒感染的敏感度,增大死亡率。不過熒光增白劑對圍食膜的破壞作用是短暫的、可恢復(fù)的。甜菜夜蛾活體試驗中,更換無熒光增白劑FB28的飼料和時間的延長均會使昆蟲圍食膜結(jié)構(gòu)完整性恢復(fù)[26]。鱗翅類昆蟲實驗結(jié)果表明作為配合昆蟲毒素的增效劑(toxin enhancing agent),熒光增白劑不及幾丁質(zhì)酶等對圍食膜的破壞作用強[27];但在粗腳粉螨(Acarus siro)中,熒光增白劑[28]對圍食膜的破壞作用明顯強于幾丁質(zhì)酶,推測是內(nèi)源性的蛋白酶降解了經(jīng)口喂服的重組表達幾丁質(zhì)酶。

除了以上幾種方式外,研究還發(fā)現(xiàn)昆蟲痘病毒(Entomopoxviruses,EPV)的紡錘形包涵體可以降解家蠶圍食膜[29]。痘病毒的fusolin蛋白可增加多角體病毒對黏蟲(Armyworm)細胞系的附著,增強病毒感染率[30]。而通過外源引入雙鏈RNA破壞圍食膜蛋白的技術(shù),近年來也成為害蟲防治研究上的熱點[3]。雙鏈RNA可在宿主中腸環(huán)境中存活并被腸絨毛上皮吸收,形成RNA干擾,進而降低靶基因和蛋白的表達[31-34]。

2 對蝦圍食膜

對蝦屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda),甲殼綱(Crustacea),十足目(Decapoda)。對蝦的消化道主要分為 4個部分,依次是食道、胃、腸道以及消化腺——肝胰腺。中腸是對蝦腸道的主要結(jié)構(gòu),其中包括與胃交界的一對前盲囊、中腸管和與后腸交界的一個后盲囊。前后盲囊有產(chǎn)生圍食膜、分泌消化酶、吸收營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)節(jié)滲透壓的作用[35]。對蝦圍食膜也是由幾丁質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物組成的非細胞結(jié)構(gòu),它覆蓋在中腸內(nèi)腔上皮細胞表面,前端有兩個側(cè)孔,通往前盲囊,后端的一背孔,通往后盲囊[36]。若干蝦類中腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)被前人不同程度描述過：淡水克氏原鰲蝦(Procambarus clarkii)[37]、勒氏長唇蝦(Derocheilocaris remanei)[38]、海鉤蝦(Gammarus oceanicus)[39]、糠蝦(Mysidacea)[40]、銳脊單肢蝦(Sicyonia ingentis)[5]和中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)[41-42]等。盡管圍食膜是中腸重要組成部分,但是其與病毒相互作用的研究卻屬空缺。

最早的類圍食膜蛋白是1999年在果蠅中發(fā)現(xiàn)的,這是一種在胚胎氣管(embryonic tracheae)中表達的蛋白,其分布在養(yǎng)分或氣體交換的不同管道中,能抵抗外界微生物或病毒的入侵[43]。近來人們在對蝦中找出了一些與昆蟲圍食膜因子高度相似的并具有圍食膜因子 CBD的基因, 但迄今為止對蝦圍食膜蛋白功能的研究尚未見明確報道。由于未明確與圍食膜關(guān)系,它們大多被命名為類圍食膜蛋白(peritrophin-like protein)。已發(fā)現(xiàn)的對蝦類圍食膜蛋白大都在病原刺激后有強烈變化,甚至有些具有抗菌活性。Khayat等[44]在研究短溝對蝦(Penaeoid semisulcatus)卵子形成過程中,在蝦卵中發(fā)現(xiàn)了兩條高表達的類圍食膜基因,并將其命名為蝦卵巢圍食膜蛋白(shrimp ovarian peritrophin,SOP),Du等[45]發(fā)現(xiàn)中國明對蝦中SOP同時在細菌刺激后的血細胞、心臟、胃、腸道等器官中發(fā)生明顯上調(diào)表達,Loongyai等[46]報導(dǎo)了在墨吉明對蝦 (Fenneropenaeus merguiensis)中的SOP具有抗菌活性;Pongsomboon等[47]也發(fā)現(xiàn)在斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)血細胞中存在的Peritrophin同源基因在弧菌和WSSV分別刺激后均發(fā)生顯著上調(diào)表達。這些都提示圍食膜蛋白與對蝦先天性免疫相關(guān)。

本實驗室在進行中國明對蝦 EST比對時,獲得了多條分別同昆蟲圍食膜非粘性蛋白(nonmucin)和腸道黏蛋白 IIM 高度相似的基因片段,它們都具有多個CBD。這些基因片段在弧菌和WSSV刺激后0～6 h發(fā)生了顯著表達變化[48]。通過對所獲得的類圍食膜因子基因片段中CBD三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測(圖2),可知其與昆蟲A型圍食膜因子 CBD的空間結(jié)構(gòu)(圖1)非常相似。這些已有的研究結(jié)果提示：(1)中國明對蝦類圍食膜蛋白可能是對蝦先天性免疫系統(tǒng)中的重要組成部分;(2)在已獲得的類圍食膜蛋白基因中可能存在對蝦圍食膜蛋白基因。

圖2 本實驗室所獲得的cDNA類圍食膜因子CBD的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

3 圍食膜研究對于防治對蝦WSSV病的展望

對蝦養(yǎng)殖業(yè)是中國沿海地區(qū)的重要支柱產(chǎn)業(yè),2009年中國對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量達到130萬t,為當(dāng)年世界對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的 38%(世界水產(chǎn)資訊網(wǎng) )。隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展,病害問題日益顯露,在眾多病害中,對蝦WSSV是危害最嚴(yán)重的,WSSV發(fā)病蝦池的死亡率在3～10 d即可達到100%[6]。自90年代初WSSV病爆發(fā)以來,每年都給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失,迄今無有效對策。

目前,對蝦先天性免疫研究工作基本都聚焦在體液免疫和細胞免疫方面,也取得了很大進展。人們已發(fā)現(xiàn)了多種免疫分子和抗病毒基因[49-51],獲得了抗菌肽[52]、crustin[53]、凝集素[54]、蛋白酶抑制劑[55]等,在實驗水平可用RNAi抑制WSSV[56-57],甚至可以通過抑制免疫功能基因使對蝦易感性增加[58-59]。然而相對于對蝦體液和細胞免疫的研究,物理免疫屏障相關(guān)研究仍然處于滯后狀態(tài)。

目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為WSSV主要是通過消化道感染對蝦,其腸道是感染后最早可檢測到 WSSV分子的組織之一[8-10]。通過消化道侵入的病毒必須穿過圍食膜屏障[3],然而針對對蝦圍食膜和病毒粒子相互關(guān)系的研究很少,目前只有對蝦近緣物種——銳脊單肢蝦(Sicyonia ingentis)腸道圍食膜的研究見諸報道[5]。銳脊單肢蝦圍食膜在實驗條件下,允許通過的物體直徑為 20 nm,與昆蟲圍食膜孔徑約 17～36 nm[60]相似,而最小的WSSV病毒完整顆粒直徑一般在70 nm以上[61]。因此WSSV必然用某種方式,或破壞對蝦圍食膜的正常結(jié)構(gòu),或通過與圍食膜蛋白相互作用,最終突破圍食膜屏障,感染對蝦。圍食膜作為對蝦腸道相關(guān)免疫系統(tǒng)的第一道物理防線,必然在抵御WSSV入侵中發(fā)揮了重要作用。對對蝦圍食膜蛋白-幾丁質(zhì)網(wǎng)絡(luò)及其相互作用分子在病毒感染過程中的作用研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

對昆蟲病毒進行研究,其目的是為了尋找防控病蟲害的有效方法,通過將病毒與化學(xué)試劑聯(lián)合作用,使化學(xué)試劑用量小的情況下仍保持很高的殺蟲效果,或?qū)⒕哂衅茐睦ハx圍食膜的病毒基因插入轉(zhuǎn)基因植物,使其永久獲得抗擊病蟲害的能力,其作用途徑最終都是通過破壞昆蟲腸道圍食膜的方法來促進殺蟲效果[18]。由此為對蝦抗WSSV病毒的研究提出了新的問題及啟示：(1) WSSV是如何穿透對蝦圍食膜屏障的？(2) 對蝦圍食膜以及相關(guān)蛋白在WSSV入侵過程中扮演怎樣的角色？(3) 既然破壞昆蟲圍食膜可以增加病毒的毒力,那么保護對蝦圍食膜或是增加圍食膜蛋白的表達是否可以增加對蝦的抗病毒能力？

隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,宿主對蝦和病毒W(wǎng)SSV的基礎(chǔ)理論研究滯后帶來的負面效應(yīng)日益顯露,對蝦圍食膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)類型,對蝦圍食膜蛋白以及圍食膜幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)與組成的研究不僅可以為對蝦先天性免疫系統(tǒng)提供理論基礎(chǔ),其研究結(jié)果還能為對蝦病害的防治提供新思路和新策略。

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