樊寅卯,張 蕾,秦 松嚴小軍

(1.寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室,浙江 寧波 315211;2.中國科學院 煙臺海岸帶可持續(xù)發(fā)展研究所,山東 煙臺 264003;3.中國科學院 研究生院,北京 100049)

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是體內清除氧自由基反應的第一大酶類,可以催化O-2發(fā)生歧化反應生成O2和H2O2,從而清除體內的O-2。植物體中主要含有3種SOD：MnSOD,Cu/ZnSOD和FeSOD。Cu/ZnSOD主要存在于細胞漿內;MnSOD主要存在于細胞漿和線粒體內;FeSOD存在于過氧化物酶體和葉綠體中。高等植物的FeSOD和MnSOD的序列和結構上具有較高的同源性,Cu/ZnSOD與MnSOD或FeSOD之間不存在同源性[1]。FeSOD在進化中屬于一類古老的 SOD,因為厭氧古細菌中只存在這一種 SOD酶,在動物,真核生物和真菌中一般不含F(xiàn)eSOD。

FeSOD是抗氧化代謝途徑中關鍵酶之一。FeSOD為環(huán)境誘導表達型,表達量高低受到溫度、光、激素等環(huán)境因子的影響。各種化學物質和逆境脅迫因子都能引起FeSOD的高表達,從而減少氧脅迫對機體的傷害[2]。研究表明,FeSOD與植物的抗病性、抗鹽性、耐脫水力、抗熱性、耐寒性及抗除草劑的能力密切相關[3]。另外,微藻對低溫及亞硫酸鹽的抗性也與FeSOD的活性相關。

在自然界中,雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)主要分布在淺水地帶或海邊的巖石旁。所以雨生紅球藻在整個生長的過程中不可避免的要遇到不良的生存環(huán)境,例如：營養(yǎng)缺乏、高溫、干旱、紫外線傷害、高光強和冷(凍)害等。雨生紅球藻能夠適應不良的生存環(huán)境,一方面是雨生紅球藻可以通過不同細胞形態(tài)之間的轉變,即在適宜的環(huán)境中,它以綠色游動細胞的形式出現(xiàn),一旦環(huán)境不適宜,其細胞壁加厚形成孢子囊[4]。另一方面是通過抗氧化系統(tǒng),在雨生紅球藻不同類型的細胞中,抗氧化機制有很大的差異,雨生紅球藻細胞內存在兩種抗氧化機制,一是綠色細胞中的抗氧化酶體系,二是紅色細胞中的抗氧化物質蝦青素,這兩種抗氧化機制同時存在,共同作用[5]。對雨生紅球藻FeSOD的克隆和表達分析有助于揭示雨生紅球藻對環(huán)境的適應機理,以及抗氧化抗逆性的生理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種和培養(yǎng)方法

雨生紅球藻為中科院煙臺海岸帶所生物資源實驗室所培養(yǎng),在溫度為 25℃,3000 lx的光照強度,12h/12h的光暗周期,與 MCM[6]培養(yǎng)基條件下靜置培養(yǎng),每天搖動一次。

1.1.2 試劑與儀器設備

試劑：Taq DNA聚合酶(Takara)、pMD-18T (Takara)、The SMART? RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)、RNAprep pure Plant Kit(Tiangen)、反轉錄試劑盒(Takara)、氨芐青霉素鈉(Sangon)、Marker(Takara)、膠回收試劑盒(Takara)、引物合成和測序送上海生工生物技術有限公司完成、大腸桿菌菌種top10(Escherichia colitop10)由本實驗室保存。

主要儀器設備：主要使用儀器：光照培養(yǎng)箱(江南儀器廠)、PCR儀(Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad),低溫臺式離心機(ABI)、高壓滅菌鍋(上海精宏)、恒溫水浴鍋(上海精宏)。

1.2 方法

1.2.1 雨生紅球藻總RNA的提取

采用RNA提取試劑盒(RNAprep pure Plant Kit)提取雨生紅球藻的總RNA,具體操作參考RNAprep pure Plant Kit試劑盒的說明書。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成

反轉錄反應體系(20 μL)如下：RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL;MMLV RT Buffer(5×)4 μL;MMLV RNaseH-(200 U/μL)0.5 μL;dNTP(10 mmol/L)2μL;Oligo dT15(0.2 mmol/L)2 μL;H2O(RNase-Free)5.5 μL;總 RNA(0.5 μg)5 μL。42℃溫育 2 h,95℃變性 2 min,－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR法克隆HpFeSOD cDNA片段

根據(jù)GenBank中已注冊的FeSOD氨基酸序列,用 codehop[7]設計雨生紅球藻FeSOD的簡并引物。codehop設計的簡并引物 HpFeSODF1(5′-CCCAGATCTGGAACCACACCy-tntaytggva-3′)和 HpFeSODR1(5′-CGGTAGTCGATGTAGTAGGCGtgytcccanac-3′)。所有引物均由上海生物工程公司合成,見表1。

取第一鏈反應產物 1 μL,按下列反應體系(25 μL)PCR 擴增：10xPCR Buffer 2.5 μL;dNTP 2 μL;上下游簡并PCR引物(10 mmol/L)1 μL;Taq DNA聚合酶(50 μ/L)0.25 μL;第一鏈反應的產物 1 μL;H2O 17.3 μL。

PCR擴增的程序是：94℃4 min,1個循環(huán);94℃30 s,55℃30 s,72℃3 min,35 個循環(huán);72℃10 min,1個循環(huán);4℃保存。

取20 μL PCR反應產物以1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析和回收;目的 DNA片段的膠回收參閱TAKARA公司的小量膠回收試劑盒說明書,凝膠的制備和操作參考分子克隆實驗指南(第3版)[8]。

1.2.4 目的DNA片段的連接及轉化

按照TaKaRa公司的T-A克隆載體連接試劑盒的說明書,將目的 DNA片段與 pMD18-T質粒載體16℃過夜連接;連接后轉化已制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞,37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和連接轉化等操作參考分子克隆實驗指南(第3 版)[8]。

表1 實驗中用到的引物及序列Tab.1 Primers used in the experiments

1.2.5 陽性克隆的篩選與檢測

挑取能在含有Amp的LB培養(yǎng)基平板上生長的單菌落,進行PCR檢測。

1.2.6 測序

跟據(jù)電泳檢測結果,挑取較好的克隆菌液 200μL送到上海生工進行測序。

1.2.7 RACE技術擴增HpFeSOD全序列

1.2.7.1 RACE-PCR引物的設計和合成

BLAST比對以上測序得到的HpFeSOD部分片段序列,發(fā)現(xiàn)它與其他物種FeSOD同源性很高,根據(jù)所測的序列再設計正向(HpFeSOD RACE F1)、反向(HpFeSOD RACE R1)引物,用 RACE技術擴增HpFeSOD的cDNA全長。

1.2.7.2 SMART RACE cDNA的合成

RACE-PCR操作步驟參照The SMART? RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)操作手冊。

1.2.7.3 3′RACE-PCR反應體系和擴增條件

3′RACE-PCR 反應體系(50 μL)：50×Advantage 2 Polymerase Mix 1 μL;10 mmol/L dNTP Mix 1 μL;3′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL;10 μmol/L UPM 引物 5 μL;PCR-Grade Water 33.5 μL;10×Advantage 2 PCR Buffer 5μL。

5′RACE-PCR 反應體系(50 μL)：10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL;10 mmol/L dNTP Mix 1 μL;5′-RACE-Ready cDNA 2.5μL;10 μmol/L UPM 引物5μL;PCR-Grade Water 33.5 μL;50×Advantage 2 Polymerase Mix 1μL。

擴增程序：94℃30 s,72℃2 min,5個循環(huán);94℃30 s,70℃30 s,72℃2 min,5個循環(huán);94℃30 s,68℃30 s,72℃2 min28個循環(huán);72℃10 min,1個循環(huán);4℃保溫。

1.2.7.4 RACE產物的純化、克隆及測序

克隆、測序等方法同前。

1.2.8 序列分析

1.2.8.1 序列的網(wǎng)上比對與分析

將所測得的序列利用 NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上的 BLAST工具進行序列相似性及同源性查找,并利用這些序列進行同源性的比較,cDNA全長序列 ORF分析用 www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站ORF finder在線分析。

1.2.8.2 氨基酸序列分析

通過在線翻譯軟件(http：//www.bio-soft.net/sms/)把得到的HPFeSOD序列翻譯成氨基酸序列,序列分析工具(ProtParam)來分析HPFeSOD蛋白的理化特性和一級的結構。ProtScale軟件來預測HPFeSOD蛋白的疏水結構,用Swiss-model構建HPFeSOD蛋白的高級結構模型。

1.2.8.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取 GenBank中不同種類的FeSOD采用ClustalW2軟件進行多序列比對分析,創(chuàng)建一個不同來源的FeSOD多序列的比對結果;系統(tǒng)發(fā)生和進化的分析在比對的基礎上用MEGA 4.0[9]軟件完成,系統(tǒng)樹采用N-J方法構建。

2 結果

2.1 總RNA提取及檢測

從雨生紅球藻細胞中提取總 RNA,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果證實獲得的總 RNA完整性較好,質量高,可以進行后續(xù)實驗。

2.2 HpFeSOD特異性片段的RT-PCR擴增與鑒定

以雨生紅球藻總RNA反轉錄后得到的cDNA第一條鏈為模板,以簡并引物HpFeSODF1/HpFeSODR1進行RT-PCR擴增。PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得一個片段。將該片段進行測序,長度為393 bp。登錄GenBank數(shù)據(jù)庫比較發(fā)現(xiàn),該片段氨基酸序列與杜氏藻(Dunaliella salina)FeSOD(GenBank登錄號：AAX92665)的相似為 90%,與萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)FeSOD(GenBank登錄號：EDP05850)的相似性為 82%,與團藻(Volvox carter f.nagariensis)FeSOD(GenBank登錄號：XP_002946030)的相似性為 80%,與石莼(Ulva fasciata)FeSOD(GenBank 登錄號：ABR23159)的相似性為 86%,與小球藻(Chlorella pyrenoidosa)FeSOD(GenBank登錄號：ABA71697)的相似為83%,表明該片段是所要克隆的目的基因的中間片段。

2.3 HpFeSOD 3′端和 5′端的克隆

根據(jù)克隆獲得的HpFeSODcDNA部分序列信息,設計合成雨生紅球藻 3′和 5′RACE-PCR 特異性引物(HpFeSOD RACE F1,UPGSP-3)和(HpFeSOD RACE R1,UPGSP-5),進行RACE-PCR反應。3′RACE -PCR反應后,電泳圖譜顯示在1200bp的位置有一條PCR條帶,5′RACE-PCR反應后,電泳圖譜顯示在650 bp的方位有一條 PCR條帶,將條帶切下并進行膠回收,克隆到 pMD18-T體中,然后篩選陽性克隆送上海生工測序。通過BLAST分析表明,該兩個片段編碼的氨基酸序列和已報道的FeSOD有高度的同源性,表明擴增得到的序列是HpFeSOD3′和HpFeSOD5′端的序列。

2.4 HpFeSOD全長的克隆

根據(jù)所獲得的中間片段,5′端和 3′端拼接出HpFeSOD的全長cDNA序列。GenBank中HPFeSOD的序列注冊編號是 JN603045,其中開放閱讀框(ORF)有684個堿基組成,其編碼的氨基酸有227個;5′非編碼區(qū)的堿基為63個、3′非編碼區(qū)的堿基為395個并含有終止密碼子TAA和加尾信號。

2.5 HpFeSOD編碼蛋白的生化特性分析

2.5.1 HpFeSOD編碼蛋白的理化特性分析

利用 ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)工具對HPFeSOD蛋白的理化特性進行分析。在HPFeSOD的氨基酸中,其中有 23個帶負電的氨基酸殘基(Asp+Glu),占總數(shù)的 10.1%,編碼的氨基酸為227個,24個帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys),占總數(shù)的10.6%。HPFeSOD蛋白的理論等電點為7.86,分子質量是25.5 ku,在大腸桿菌E.coil中的半衰期大于10 h,穩(wěn)定系數(shù)為69.40,所以表明HPFeSOD是穩(wěn)定的蛋白質。

2.5.2 HpFeSOD蛋白三級結構的預測

HPFeSOD蛋白的高級結構模型依據(jù)同源建模的預測方法用 Swiss-model[10]模型構建(圖1)。HPFeSOD蛋白結構：C端區(qū)由4個螺旋的超二級結構和一個擰成三股β折疊片組成。HPFeSOD蛋白由15個卷曲、3個β折疊片、10個轉角的結構和11個α螺旋組成,其蛋白結構的 N端區(qū)主要是 4個長的反平行螺旋構成。

圖1 HPFeSOD空間結構預測Fig.1 The predicted dimensional structure of HPFeSOD

2.6 HpFeSOD與其他真核藻類的FeSODs多序列比對分析

利用BLASTX和CLUSTALW2分析軟件對克隆得到的HpFeSOD與已報道的一些藻類的FeSODs進行同源比對分析。分析表明：序列之間的同源性比較高,在多個位點出現(xiàn)連續(xù)幾個氨基酸一致的情況,特別是在 3個保守的氨基酸簇處(NNAAQVWNHEFFWESMK、AGLTQFGSGWAW、PILTCDMWEHAYYIDYQNRRPD)。雨生紅球藻(HpFeSOD)與杜氏藻(DsFeSOD)、衣藻(CrFeSOD)、團藻(VcFeSOD)、石莼(UfFeSOD)、顫藻(OsFeSOD)蛋白的同源性為89%、83%、78%、70%、63%。不同種屬的藻類的FeSOD蛋白都具有較高的同源性,表明FeSOD進化的保守性。細胞質定位的FeSODN端氨基酸的同源性高于C端(圖2)。

2.7 FeSOD系統(tǒng)發(fā)生進化分析

作者在 Genbank上下載了 20條其他物種的FeSOD氨基酸序列,通過構建系統(tǒng)發(fā)生進化樹來研究FeSOD與其他物種的進化關系。從系統(tǒng)發(fā)生進化樹圖譜(圖3)看到：綠藻門的FeSODs聚合在一起,藍藻門的FeSODs聚合在一起,高等植物的FeSODs聚合在一起,細菌的FeSODs聚合在一起。結果表明：不同物種的FeSOD在進化過程中是保守性,可以很好的反應各物種之間的進化距離。從系統(tǒng)進化樹中看到雨生紅球藻FeSOD和杜氏藻FeSOD在進化關系上最近,介于真菌與高等植物之間,并且真核微藻FeSOD與高等植物的FeSOD同源性高,推測雨生紅球藻FeSOD在進化上可能與高等植物的進化關系較近。

3 討論與小結

藻類中尤其是微藻由于其生長環(huán)境的特殊性經常受到高氧化環(huán)境的脅迫(比如高溫,低溫或是冰凍),這些不良的因素嚴重的影響藻類的正常生長。藻類擁有一些機制來應對逆境因子的影響并保護藻體免受不可恢復的損傷,跟藻類抗逆相關的機制有DNA修復、光保護物質、抗氧化活性系統(tǒng)等。研究發(fā)現(xiàn),藻類在經過逆境的脅迫后,SOD會被誘導并高度表達[11]。這是因為SOD等內源性的活性氧清劑能夠在逆境脅迫條件下除去過量的活性氧,從而維持機體的代謝平衡,保護細胞的膜結構,緩解植物體發(fā)生不良反應的機會,所以SOD與植物耐逆的能力有著非常大的關系[12]。

FeSOD是藻類抗逆相關基因之一,可使藻體抵抗逆境引起的氧化脅迫能力增強。目前,國內外對于藻類抗逆相關基因FeSOD的研究為數(shù)不多。Desaik等[12]的研究表明一些海洋藻類在受到紫外線照射脅迫和溫度脅迫后,它們體內的MnSOD會被誘導并高度表達。Slooten等[13]蒓報道了石在受到除草劑和紫外線照射脅迫后,MnSOD和FeSOD都受到了誘導并且得到表達,不同的脅迫方式其的SOD的表達水平是不同的。Badawi等[14]的研究發(fā)現(xiàn)水稻FeSOD受到高度的表達可以提高其的耐凍性,還有他們也對番茄進行了抗寒能力的實驗,實驗結果表明如果番茄在發(fā)育期比如花期和苗期用低溫脅迫一下,番茄的抗寒力能力顯著提高,隨之其體內的SOD的活性也顯著升高,對抗寒力弱的品種進行研究發(fā)現(xiàn)其體內的SOD活性活性升高不大。

圖2 HpFeSOD與其他真核藻類FeSOD氨基酸序列比對結果Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequences between HPFeSOD and other weeds

本實驗利用簡并PCR和RACE技術從雨生紅球藻中克隆了FeSOD,雨生紅球藻其他抗逆相關的基因也可以通過類似的方法克隆獲得,并利用生物學軟件對該序列進行了氨基酸使用頻率的統(tǒng)計、同源性比較分析、功能結構域的預測等,為微藻FeSOD的結構和特性的研究提供參考。并為進一步研究該基因的表達強度與抗逆的相關性和微藻FeSOD抗逆的分子機理奠定基礎。

圖3 利用鄰接法構建藻類、細菌和高等植物FeSODs的系統(tǒng)發(fā)生進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of FeSODs constructed with the N-J method

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