黃志清 陳小玲 陳代文 余 冰 何 軍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安625014）

機(jī)體受到病原微生物感染時(shí)，促炎細(xì)胞因子的適量分泌對(duì)機(jī)體抵抗感染是有利的，但過(guò)量分泌則會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。能否通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的手段來(lái)減少促炎細(xì)胞因子的過(guò)量分泌以緩解免疫應(yīng)激，受到了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。長(zhǎng)鏈n－3多不飽和脂肪酸（LC n－3PUFA）是動(dòng)物體內(nèi)必需的多不飽和脂肪酸，包括二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），可通過(guò)影響免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞的功能實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，是近年來(lái)免疫營(yíng)養(yǎng)素中的研究熱點(diǎn)。迄今，LC n－3PUFA在外周血單核細(xì)胞［1］、巨 噬細(xì)胞［2］、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［3－4］和呼吸 道 上 皮 細(xì)胞［5－6］等 不同 細(xì) 胞 中 被 證實(shí)具有抗炎作用，其抗炎作用主要是通過(guò)減少腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白介素－1β（IL－1β）和白介素－6（IL－6）等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但LC n－3PUFA是否也能減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以發(fā)揮其在腸上皮細(xì)胞中的抗炎作用，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。由于腸上皮細(xì)胞是抵御病原菌通過(guò)腸道進(jìn)入機(jī)體的第一道防線［7］，證實(shí) LC n－3 PUFA在腸上皮細(xì)胞中的抗炎作用具有重要意義?；诖?，本試驗(yàn)以大鼠腸上皮細(xì)胞系IEC－6細(xì)胞為研究對(duì)象，探討LC n－3PUFA對(duì)腸上皮細(xì)胞促炎細(xì)胞因子基因mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，DHA、EPA、脂 多 糖 （LPS，大 腸 桿 菌 血 清 型O55∶B5）、牛胰島素（bovine insulin）和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，總RNA提取試劑（RNAiso Plus reagent）、反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser）購(gòu)自日本TaKaRa公司，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（SsoFast EvaGreen Supermix）購(gòu) 自 美 國(guó) Bio－Rad公司。

1.2 IEC－6細(xì)胞培養(yǎng)

正常大鼠腸上皮細(xì)胞系IEC－6細(xì)胞（第14代）購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。取液氮保存的IEC－6細(xì)胞，于37℃水浴快速解凍，加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液（90%DMEM、10%FBS、0.1U／mL牛胰島素、100U／mL 青 霉 素 ＋100 μg／L 鏈 霉 素 ），1 000r／min離心5min，去上清液。沉淀的細(xì)胞用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液懸浮，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning公司），于37℃、5%CO2、飽和濕度中培養(yǎng)，每3d換液1次。

1.3 EPA、DHA和LPS處理

當(dāng)IEC－6細(xì)胞達(dá)80%左右匯合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以起始細(xì)胞密度3×105個(gè)／孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板（美國(guó)Corning公司）中。

試驗(yàn)分為4個(gè)處理，分別為對(duì)照、LPS、DHA＋LPS和EPA＋LPS，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每孔為1個(gè)重復(fù)。接種8h后，分別于相應(yīng)處理中加入DHA、EPA或DMSO（DHA和EPA的溶劑），使它們的終濃度為100μmol／L，預(yù)處理細(xì)胞48h，再加入LPS使其終濃度為1μg／mL，處理3h后，收集細(xì)胞提取總RNA。

1.4 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用RNAiso Plus reagent提取細(xì)胞總RNA，采用Beckman Coulter DU 800核酸蛋白測(cè)定儀于260和280nm處檢測(cè)RNA的濃度和純度。cDNA合成按照PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，總RNA為1μg，反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)結(jié)束后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）基因?yàn)楣芗一蜻M(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表1。所有實(shí)時(shí)定量PCR均使用PCR儀（CFX－96 real－time PCR system，美國(guó) Bio－Rad公司）進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。20μL反應(yīng)總體系：cDNA 2μL，上、下游引物各1μL（工作濃度為0.5μmol／L），焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過(guò)的水6μL，2×SsoFast EvaGreen Supermix 10μL。反應(yīng)條件為：98℃2min；98℃2s，60℃5s，共45個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析反應(yīng)程序?yàn)樽?5℃開始，每秒升高0.5℃直至到95℃結(jié)束。mRNA相對(duì)表達(dá)量采用Pfaffl［8］的分析方法進(jìn)行。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers for the real－time quantitative PCR

1.6 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。顯著水平以P＜0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 LC n－3PUFA對(duì)IEC－6細(xì)胞中TNF－α的基因mRNA表達(dá)的影響

從圖1可知，與對(duì)照處理相比，LPS、DHA＋LPS和EPA＋LPS處理均極顯著上調(diào)了IEC－6細(xì)胞中TNF－α的基因 mRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。與LPS處理相比，EPA＋LPS處理極顯著下調(diào)了IEC－6胞中TNF－α的基因 mRNA表達(dá)水平（P＜0.01），而DHA＋LPS處理對(duì)IEC－6細(xì)胞中TNF－α的基因mRNA表達(dá)水平則沒(méi)有顯著影響（P＝0.156）。

圖1 LC n－3PUFA對(duì)IEC－6細(xì)胞中TNF－α的基因mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effects of LC n－3PUFA on gene mRNA expression of TNF－αin IEC－6cells

2.2 LC n－3PUFA對(duì)IEC－6細(xì)胞中IL－1β的基因mRNA表達(dá)的影響

從圖2可知，與對(duì)照處理相比，LPS、DHA＋LPS和EPA＋LPS處理均極顯著上調(diào)了IEC－6細(xì)胞中IL－1β的基因 mRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。與LPS處理相比，DHA＋LPS處理和EPA＋LPS處理分別顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）下調(diào)了IEC－6細(xì)胞中TNF－α的基因 mRNA表達(dá)水平。

圖2 LC n－3PUFA對(duì)IEC－6細(xì)胞中IL－1β的基因mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of LC n－3PUFA on gene mRNA expression of IL－1βin IEC－6cells

2.3 LC n－3PUFA 對(duì)IEC－6 細(xì) 胞 中IL－6的 基 因mRNA表達(dá)的影響

從圖3可知，與對(duì)照處理相比，LPS、DHA＋LPS和EPA＋LPS處理均極顯著上調(diào)了IEC－6細(xì)胞中IL－6的基因mRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。與LPS處理相比，EPA＋LPS處理顯著下調(diào)了IEC－6細(xì)胞中IL－6的基因mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），而DHA＋LPS處理對(duì)IEC－6細(xì)胞中IL－6的基因mRNA表達(dá)水平則沒(méi)有顯著影響（P＝0.736）。

圖3 LC n－3PUFA對(duì)IEC－6細(xì)胞中IL－6的基因mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of LC n－3PUFA on gene mRNA expression of IL－6in IEC－6cells

3 討 論

腸上皮細(xì)胞是腸道黏膜屏障的重要組成部分。IEC－6細(xì)胞來(lái)自正常大鼠空腸隱窩上皮，體外易于培養(yǎng)，具有原始腸上皮細(xì)胞相同的細(xì)胞學(xué)特性和形態(tài)學(xué)特征［9］。因此，IEC－6細(xì)胞通常成為體外研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與腸道細(xì)胞免疫關(guān)系的首選模型。

腸道致病菌均為革蘭氏陰性（G－）菌，LPS是G－菌細(xì)胞壁上主要的致病成分。動(dòng)物的腸腔表面不斷地暴露于G－菌和LPS環(huán)境中，腸上皮細(xì)胞在受到 LPS刺激時(shí)，可產(chǎn)生 TNF－α、IL－1β和IL－6等促炎細(xì)胞因子［10－12］。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，LPS刺激后，TNF－α、IL－1β和IL－6的基因 mRNA 表達(dá)水平均極顯著升高，暗示細(xì)胞處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，EPA均顯著削弱了細(xì)胞內(nèi)LPS誘導(dǎo)的TNF－α、IL－1β和IL－6的基因 mRNA 水平的上調(diào)，而DHA僅顯著削弱了細(xì)胞內(nèi)LPS誘導(dǎo)的IL－1β的基因mRNA水平的上調(diào)，表明EPA在腸上皮細(xì)胞中的抗炎作用要優(yōu)于DHA。然而，在巨噬細(xì)胞［2］和呼吸道上皮細(xì)胞［5］中的結(jié)果則相反。由此可以看出，盡管EPA和DHA均具有的抗炎作用，但其抗炎效果因細(xì)胞種類的不同而有所差異，這些差異更深層次地反映了其在不同組織器官甚至特定疾病中的作用效果存在差異。

體內(nèi)研究LC n－3PUFA的免疫調(diào)節(jié)作用，以往常采用添加主要成分為EPA和DHA的魚油來(lái)進(jìn)行［13－16］，罕見(jiàn)采用單獨(dú)添加 EPA 或 DHA 的報(bào)道［17］。盡管魚油被報(bào)道對(duì)炎性腸病等疾病的治療有一定的有利作用［18］，但由于為EPA和DHA的混合物，限制了人們對(duì)單一成分治療效果的認(rèn)識(shí)。本試驗(yàn)結(jié)果也提示，其單一成分的治療效果很可能不同。因此，今后有必要體內(nèi)研究EPA和DHA分別在炎性腸病等疾病中的治療效果。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)首次證實(shí)了LC n－3PUFA在腸上皮細(xì)胞中的抗炎作用，且在本試驗(yàn)條件下EPA的抗炎效果要優(yōu)于DHA。

［1］ MAYER K，MEYER S，REINHOLZ M M，et al.Short－time infusion of fish oil based lipid emulsions，approved for parenteral nutrition，reduces monocyte proinflammatory cytokine generation and adhesive interaction with endothelium in humans［J］.Journal of Immunology，2003，171（9）：4837－4843.

［2］ WELDON S M，MULLEN A C，LOSCHER C E，et al.Docosahexaenoic acid induces an anti－inflammatory profile in lipopolysaccharide－stimulated human THP－1macrophages more effectively than eicosapentaenoic acid［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2007，18（4）：250－258.

［3］ MARCHESELLI V L，HONG S，LUKIW W J，et al.Novel docosanoids inhibit brain ischemia－reperfusion－mediated leukocyte infiltration and pro－inflammatory gene expression［J］.Journal of Biological Chemistry，2003，278（44）：43807－43817.

［4］ MOON D O，KIM K C，JIN C Y，et al.Inhibitory effects of eicosapentaenoic acid on lipopolysaccharide－induced activation in BV2microglia［J］.International Immunopharmacology，2007，7（2）：222－229.

［5］ SAEDISOMEOLIA A，WOOD L G，GARG M L，et al.Anti－inflammatory effects of long－chain n－3PUFA in rhinovirus－infected cultured airway epithelial cells［J］.British Journal of Nutrition，2009，101（4）：533－540.

［6］ 史艷莉，李翠娥，代方梅，等.n－3多不飽和脂肪酸對(duì)運(yùn)動(dòng)性哮喘豚鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的影響［J］.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2010，29（6）：669－672，687.

［7］ LIU F，LI G，WEN K，et al.Porcine small intestinal epithelial cell line （IPEC－J2）of rotavirus infection as a new model for the study of innate immune responses to rotaviruses and probiotics［J］.Viral Immunology，2010，23（2）：135－149.

［8］ PFAFFL M W.A new mathematical model for relative quantification in real－time RT－PCR［J］.Nucleic Acids Research，2001，29：45.

［9］ QUARONI A，WANDS J，TRELSTAD R L，et al.Epithelioid cell cultures from rat small intestine：characterization by morphologic and immunological criteria［J］.Journal of Cell Biology，1979，80（2）：248－265.

［10］ ARCE C，RAMíREZ－BOO M，LUCENA C，et al.Innate immune activation of swine intestinal epithelial cell lines （IPEC－J2and IPI－2I）in response to LPS fromSalmonella typhimurium［J］.Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases，2010，33（2）：161－174.

［11］ LYU S Y，PARK W B.Mistletoe lectin modulates intestinal epithelial cell－derived cytokines and B cell IgA secretion［J］.Archives of Pharmacal Research，2009，32（3）：443－451.

［12］ 蔡景義，周安國(guó)，田剛，等.氧化鋅對(duì)LPS處理豬腸上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌及基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)畜牧雜志，2011，47（23）：47－50.

［13］ CAUGHEY G E，MANTZIORIS E，GIBSON R A，et al.The effect on human tumor necrosis factorα and interleukin 1βproduction of diets enriched in n－3 fatty acids from vegetable oil or fish oil［J］.American Journal of Clinical Nutrition，1996，63（1）：116－122.

［14］ CLELAND L G，JAMES M J，PROUDMAN S M.Dietary fats and inflammation：the medicinal use of fish oil［J］.Nutrition ＆Dietetics，2009，66（1）：4－6.

［15］ HALADE G V，WILLIAMS P J，LINDSEY M L，et al.Fish oil decreases inflammation and reduces cardiac remodeling in rosiglitazone treated aging mice［J］.Pharmacological Research，2011，63（4）：300－307.

［16］ MONK J M，KIM W，CALLAWAY E，et al.Immunomodulatory action of dietary fish oil and targeted deletion of intestinal epithelial cell PPAR delta in inflammation－induced colon carcinogenesis［J］.A－merican Journal of Physiology：Gastrointestinal and Liver Physiology，2012，302（1）：G153－G167.

［17］ KEW S，MESA M D，TRICON S，et al.Effects of oils rich in eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids on immune cell composition and function in healthy humans［J］.American Journal of Clinical Nutrition，2004，79（4）：674－681.

［18］ ALEXANDER J W.Immunonutrition：the role of N－3fatty acids［J］.Nutrition，1998，14（7／8）：627－633.