謝婉瑩 侯新燕 閆峰賓 韓瑞麗 孫桂榮 康相濤

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省家禽種質(zhì)資源工程研究中心，鄭州450002）

斷喙是集約化生產(chǎn)條件下控制雞群互相咬啄傷害和防止飼料浪費的有效措施之一，斷喙后雞羽毛生長良好，死亡率降低［1］。然而，隨著動物行為學(xué)和動物福利學(xué)說的產(chǎn)生，斷喙問題成為了人們爭論的焦點。Gentle等［2－3］發(fā)現(xiàn)斷喙所導(dǎo)致的組織及神經(jīng)損傷會給雛雞帶來急性或長期的疼痛。組織損傷能夠引起炎性反應(yīng)、細胞因子的表達及細胞凋亡［4－6］。孫桂榮等［7］研究發(fā)現(xiàn)，斷喙應(yīng)激可導(dǎo)致雞胸腺細胞凋亡，且有降低細胞凋亡抑制基因B細胞淋巴瘤／白血病2（B－cell lympoma／leukemia－2，Bcl－2）在胸腺細胞內(nèi)表達量的趨勢。研究證明，斷喙會造成雛雞強烈應(yīng)激［8］，應(yīng)激在啟動凋亡通路，引起細胞凋亡的同時又能抑制免疫，這種應(yīng)激性免疫抑制是生產(chǎn)實踐中許多疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。目前，緩解斷喙應(yīng)激對雛雞的不利影響，進而提高經(jīng)濟效益已成為研究熱點。γ－氨基丁酸（GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一個主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它不僅廣泛分布于動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，而且也分布于外周神經(jīng)和非神經(jīng)組織的細胞中，在非神經(jīng)組織中發(fā)揮激素或營養(yǎng)因子的功能［9］。GABA極易溶于水，作為一種鎮(zhèn)痛劑，在人類及動物中廣泛應(yīng)用［10］。此外，Cherubini等［11］研究發(fā)現(xiàn)GABA具有緩解應(yīng)激、改善食欲、提高營養(yǎng)利用率的作用。迄今為止，GABA在斷喙應(yīng)激中所發(fā)揮的作用還未有涉及。因此，本試驗擬通過研究不同水平GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞生長性能、血清細胞因子含量及脾臟細胞凋亡相關(guān)基因Bcl－2和Fas基因mRNA表達量的影響，并分析Bcl－2和Fas基因與細胞因子的關(guān)系，探討其作用的機理，旨在為其生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

選取1日齡體重均勻的健康固始雞公雛360只，隨機分為A、B、C、D、E 5個組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)12只雞。其中A、B、C組斷喙，飲水中分別添加40、60和80mg／kg GABA；D組不斷喙，不添加GABA；E組斷喙，不添加GABA。試驗基礎(chǔ)飼糧參照NRC（1994）配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。雞舍溫度控制在28～30℃，自由采食和飲水。每天記錄死亡率。于斷喙后第1、3、5、7天記錄體重（BW）和采食量（FI）。GABA由上海源聚生物技術(shù)有限公司提供，純度＞99.7%。

1.2 樣品制備

雛雞于7日齡時斷喙，于斷喙后第1、3、5、7天從每重復(fù)中各取1只雞心臟采血，分離出血清，于－20℃保存，用于血清炎性因子含量的檢測，處死后迅速摘取約100g脾臟，于液氮速凍后轉(zhuǎn)移至－70℃保存，用于提取總RNA。

1.3 血清細胞因子含量的測定

酶聯(lián)免疫吸附劑（ELISA）法檢測血清白細胞介素1β（IL－1β）、白細胞介素6（IL－6）和腫瘤壞死因子α（TNF－α）含量，嚴格按雞的 ELISA試劑盒（R＆D Systems，上海江萊生物科技有限公司）說明書操作，每樣品做2個復(fù)孔。按繪制的標準曲線，換算出3種細胞因子的含量。

1.4 脾臟Bcl－2和Fas基因mRNA表達量的檢測

1.4.1 總RNA的提取和cDNA的合成

取50～100mg脾臟組織樣，采用Trizol法提取組織總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用NanoDrop 2000紫外分光光度計檢測其濃度，根據(jù)OD260／OD280的比值（R值）判定RNA的純度。按照PrimeScript cDNA第一鏈合成試劑盒（寶生物工程有限公司，大連）操作說明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient level of the basal diet（air－dry basis） %

1.4.2 目的基因引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上公布的雞的Bcl－2和Fas基因mRNA序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列及參數(shù)見表2。

表2 PCR引物序列及參數(shù)Table 2 Primers sequences and parameters

1.4.3 PCR反應(yīng)

用EasyTaq DNA Polymerase試劑盒對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25μL：1μL cDNA；1μL目的基因上、下游引物；2.5μL，10×EasyTaq Buffer；2μL 2.5mmol／L dNTPs；0.25 μL EasyTaq DNA Polymerase；17.25μL dH2O。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃，30s；50～55℃，30s；72℃，30s；共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

1.4.4 PCR產(chǎn)物的回收及測序

將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用EasyPure Quick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒純化。純化產(chǎn)物送至寶生物工程有限公司測序。

1.4.5 實時熒光定量PCR反應(yīng)

采用SYBR Green染料法在ABI StepOne－PlusTM實時熒光定量PCR擴增儀上進行擴增。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Ⅱ10.0μL，F(xiàn)orward Primer 0.8μL，Reverse Primer 0.8μL，cDNA模板2.0μL，加dH2O至20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，60℃退火40s，72℃延伸15s，40個循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析，判定引物的特異性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以GAPDH 管家基因作為內(nèi)參，對Bcl－2和Fas基因進行相對定量分析。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（mean±SD）表示。采用2－△△Ct法對熒光定量結(jié)果進行計算。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件的一般線性模型（GLM）進行雙因素方差分析和Duncan氏法多重比較。以P＜0.05為顯著性標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞生長性能的影響

由表3可見，斷喙后第1天各組之間雛雞體重并沒有顯著差異（P＞0.05），然而，在斷喙后第3天，與未斷喙組（D組）相比，斷喙應(yīng)激導(dǎo)致雛雞體重顯著下降，添加80mg／kg GABA組雛雞體重顯著高于斷喙未添加GABA組（P＜0.05）。斷喙后第5、7天，斷喙未添加GABA組雛雞體重顯著低于斷喙添加 GABA組（P＜0.05），且添加40、60、80mg／kg GABA 組 之 間 差 異 不 顯 著 （P＞0.05）。

與未斷喙組相比，斷喙應(yīng)激導(dǎo)致雛雞采食量顯著下降（P＜0.05），添加GABA緩解了這一應(yīng)激狀況，在斷喙后第5、7天，斷喙未添加GABA組雛雞采食量顯著低于添加80mg／kg GABA組（P＜0.05）。此外，整個試驗結(jié)束后對死亡率的統(tǒng)計結(jié)果顯示，C組雛雞死亡率最低，為2.8%，其次為D（4.2%）、B（6.9%）、A 組（8.3%），E組雛雞死亡率最高，為12.9%。

2.2 GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞血清中細胞因子含量的影響

由表4可見，斷喙應(yīng)激刺激了IL－1β、TNF－α和IL－6 3種細胞因子的分泌，斷喙后第1、5天血清IL－1β含量顯著高于未斷喙組（P＜0.05）。與斷喙未添加GABA組相比，添加80mg／kg GABA顯著降低了血清IL－1β含量（P＜0.05），而添加40 mg／kg GABA組效果不顯著（P＞0.05）。

與未斷喙組相比，斷喙后第1天血清TNF－α含量顯著 升高（P＜0.05），添 加60、80mg／kg GABA組血清TNF－α含量顯著低于斷喙未添加GABA組 （P＜0.05）；斷 喙 后 第 7 天，添 加80mg／kg GABA 顯著降低了血清 TNF－α含量（P＜0.05）。

表3 GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞體重和采食量的影響Table 3 Effects of GABA on body weight and feed intake of chicks under beak trimming stress g

斷喙后第1、7天IL－6含量顯著高于未斷喙組，添加80mg／kg GABA顯著抑制了體內(nèi)IL－6的分泌（P＜0.05）。

以上結(jié)果表明，斷喙刺激了體內(nèi)細胞因子的釋放，且呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。添加80mg／kg GABA能夠顯著降低斷喙應(yīng)激所致的雞血 清 IL－1β、TNF－α和 IL－6 含 量 的 升 高 （P＜0.05）。

2.3 Fas和Bcl－2基因引物特異性

本試驗利用實時熒光定量PCR法檢測了Fas和Bcl－2基因在雞脾臟中的表達，F(xiàn)as、Bcl－2和內(nèi)參基因GAPDH熔解曲線見圖1，可以看出，PCR擴增的熔解曲線為單峰，沒有引物二聚體及其他非特異性擴增產(chǎn)物，結(jié)合瓊脂糖電泳結(jié)果目的片段位置（結(jié)果未列出），表明相關(guān)引物具有較高的特異性，所得結(jié)果可用于后續(xù)分析。

2.4 GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞脾臟中Bcl－2和Fas基因mRNA表達量的影響

由圖2可見，與未斷喙組相比，斷喙應(yīng)激后脾臟中促凋亡基因Fas mRNA表達量升高，添加GABA后下降，在斷喙后第1、3、7天效果顯著，且隨GABA劑量加大而進一步降低，添加80mg／kg GABA組Fas mRNA表達量顯著低于斷喙未添加GABA組（P＜0.05）。

各組間脾臟內(nèi)Bcl－2mRNA的表達量差異不顯著（P＞0.05）。斷喙后1周脾臟內(nèi)Bcl－2mRNA的表達量變化趨勢緩和，但是在斷喙未添加GABA組脾臟內(nèi)相對同期對照組有降低趨勢，添加80mg／kg GABA有輕度上調(diào)抗凋亡基因Bcl－2 mRNA表達量的趨勢，但沒有達到顯著水平（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞生長性能的影響

試驗結(jié)果顯示斷喙應(yīng)激導(dǎo)致雛雞體重下降、采食量減少，添加GABA可以緩解這一癥狀，且添加80mg／kg GABA組緩解效果較好。這與前人報道基本一致。Fan等［12］研究表明GABA在改善動物生長性能方面具有良好效果，可以顯著促進其體內(nèi)生長激素的分泌。采食作為一個復(fù)雜的行為活動，主要受中樞神經(jīng)系統(tǒng)中飽中樞和攝食中樞的調(diào)節(jié)。研究證實GABA能夠促進胃酸及消化酶的分泌，同時抑制膽囊收縮素（CCK）分泌，減弱消化道食糜對采食的負反饋作用，抑制胃膨脹及飽中樞，從而提高動物采食量［13－14］。此外，Shuye等［15］研究發(fā)現(xiàn)將一定劑量范圍的GABA注射于動物的不同腦區(qū)，可顯著促進動物攝食，并具有劑量依賴效應(yīng)。雞的采食量對雞的健康、生長發(fā)育和生產(chǎn)潛能的發(fā)揮具有重要意義。本試驗顯示，添加GABA顯著提高了斷喙應(yīng)激雛雞體重，GABA可能是通過其受體作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制飽中樞的活動引起雛雞采食增加，從而影響其生長發(fā)育。

表4 GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞血清細胞因子含量的影響Table 4 Effects of GABA on serum cytokines contents of chicks under beak trimming stress ng／L

3.2 GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞血清細胞因子含量的影響

免疫系統(tǒng)對外界刺激是非常敏感的。在神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)之間存在著緊密的聯(lián)系，細胞因子是神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間信息交流的重要介質(zhì)［16］。應(yīng)激導(dǎo)致的免疫抑制的發(fā)生是各種激素和細胞因子作用的結(jié)果。Cunha等［17－19］研究表明在損傷的組織中，炎癥可能會導(dǎo)致三磷酸腺 苷（ATP）、前 列 腺 素、IL－1β、IL－6 和TNF－α等化學(xué)物質(zhì)的釋放，與前人報道一致，本試驗結(jié)果顯示，斷喙應(yīng)激刺激了IL－1β、IL－6和TNF－α 3種細胞因子的分泌。Spangelo等［20］研究發(fā)現(xiàn)，GABA可抑制IL－1β誘導(dǎo)產(chǎn)生IL－6。Joseph等［21］報道GABA能夠顯著抑制IL－6的合成。本試驗結(jié)果表明，添加GABA有效抑制了應(yīng)激導(dǎo)致的細胞因子的分泌，降低了血清中IL－1β、IL－6和 TNF－α3種細胞因子的含量，且添加80mg／kg GABA時效果顯著。據(jù)此推測，GABA可能是通過抑制細胞因子的分泌而起到了緩解應(yīng)激的效果。然而，GABA抑制細胞因子的機理還有待進一步研究。

此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，斷喙后第1、3、5、7天，血清中IL－1β、IL－6和 TNF－α3種細胞因子的含量均呈先上升后下降的趨勢，其中IL－1β和TNF－α在斷喙后第3天達到峰值，隨后逐漸下降。斷喙對雞體來說是一種不良刺激，雞體為了應(yīng)對這種刺激，除了進行行為等物理調(diào)節(jié)外，還必須改變血清中某些化學(xué)物質(zhì)水平以加強化學(xué)調(diào)節(jié)。血清中IL－1β、IL－6和 TNF－α3種細胞因子含量升高正是雞體應(yīng)對應(yīng)激刺激的生理反應(yīng)。隨后，血清中細胞因子含量呈下降趨勢說明此時雞體逐漸由以化學(xué)調(diào)節(jié)為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐晕锢碚{(diào)節(jié)為主，應(yīng)激逐漸緩解。

圖1 GAPDH，F(xiàn)as及Bcl－2基因的熔解曲線圖Fig.1 Melt curves of GAPDH，F(xiàn)as and Bcl－2genes

圖2 GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞脾臟中Fas和Bcl－2基因mRNA表達量的影響Fig.2 Effects of GABA on splenetic mRNA expression levels of Fas and Bcl－2genes of chicks under beak trimming stress

3.3 GABA對斷喙應(yīng)激條件下雛雞脾臟中Bcl－2和Fas基因mRNA表達量的影響

細胞凋亡的發(fā)生受多種基因表達的調(diào)控，凋亡刺激基因Fas與凋亡抑制基因Bcl－2被認為與細胞凋亡關(guān)系密切［22－23］。當促凋亡因素減輕或去除時，凋亡細胞可轉(zhuǎn)化為正常細胞，反之凋亡細胞則可轉(zhuǎn)化為壞死細胞［24］。本研究結(jié)果顯示，與未斷喙組相比，斷喙應(yīng)激后第1、3和7天雛雞脾臟中促凋亡基因Fas mRNA表達量顯著升高，抗凋亡基因Bcl－2mRNA表達量有下降趨勢，說明斷喙應(yīng)激導(dǎo)致了雞脾臟細胞凋亡。

引起細胞凋亡的因素很多，研究表明炎性反應(yīng)及其細胞因子的分泌表達均會引起細胞凋亡［25］。斷喙后體內(nèi)的炎性反應(yīng)及分泌表達的細胞因子IL－1β、IL－6和 TNF－α等與細胞凋亡的關(guān)系越來越引起人們的關(guān)注。Holmin等［26］給大鼠腦內(nèi)注入IL－1β和TNF－α發(fā)現(xiàn)，注入IL－1β可誘導(dǎo)短暫的炎性細胞反應(yīng)和細胞凋亡，并發(fā)現(xiàn)促凋亡基因的表達量顯著高于抗凋亡基因的表達量。Mayne等［27］則在大鼠腦出血24h內(nèi)檢測到TNF－α的表達，且發(fā)現(xiàn)使用TNF－α拮抗劑后，凋亡細胞的數(shù)目顯著減少。本研究結(jié)果顯示，與未斷喙組相比，斷喙應(yīng)激后脾臟中促凋亡基因Fas mRNA表達量顯著升高，與此同時，斷喙后血清中IL－1β、TNF－α和IL－6含量顯著高于未斷喙組。隨著血清中IL－1β、TNF－α和IL－6含量的下降，促凋亡基因Fas mRNA表達量也逐漸下降，說明IL－1β、TNF－α和IL－6與細胞凋亡有密切關(guān)系。添加GABA后顯著下調(diào)了Fas mRNA表達量，輕度上調(diào)了抗凋亡基因Bcl－2mRNA表達量，此調(diào)節(jié)作用與GABA添加劑量間存在顯著的量效關(guān)系，進一步顯示GABA對細胞凋亡時凋亡相關(guān)基因的mRNA表達量尚有一定影響，這種影響可能是通過調(diào)控體內(nèi)細胞因子的分泌而實現(xiàn)的，該作用機理還有待進一步證實。

4 結(jié) 論

① 斷喙應(yīng)激導(dǎo)致雛雞體重下降、采食量減少，添加GABA可以緩解這一癥狀。

② 斷喙應(yīng)激后雛雞免疫器官脾臟中促凋亡基因Fas mRNA表達量顯著升高，血清中細胞因子含量顯著升高，推測 GABA可通過抑制IL－1β、TNF－α和IL－6 3種細胞因子的分泌減輕炎性反應(yīng)，間接抑制細胞凋亡加劇，以緩解斷喙應(yīng)激對雛雞的不良影響，且添加80mg／kg GABA效果較好。

［1］ HESTER P Y，SHEA－MOORE M.Beak trimming egg－laying strains of chickens［J］.World’s Poultry Science，2003，59：458－474.

［2］ GENTLE M J，WADDINGTON D，HUNTER L H，et al.Behavioural evidence for persistent pain following partial beak amputation in chickens［J］.Applied Animal Behaviour Science，1990，27：149－157.

［3］ GENTLE M J，HUNTER L N，WADDINGTON D.The onset of pain related behaviours following partial beak amputation in the chicken［J］.Neuroscience Letters，1991，128：113－116.

［4］ GONG C，HOFF J T，KEEP R F.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rat［J］.Brain Research，2000，871（1）：57－65.

［5］ CASTILLO J，OAVALOS A，ALVAREZ－SABIN J，et al.Molecular signatures of brain injury after intracerebral hemorrhage［J］.Neurology，2002，58（4）：624－629.

［6］ 吳家冪，馬領(lǐng)松，周向陽，等.補體在腦出血后腦組織損傷機制中的作用［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（2）：152－154.

［7］ 孫桂榮，李燕，康相濤，等.斷喙應(yīng)激對雛雞胸腺細胞凋亡及相關(guān)凋亡蛋白表達的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42（7）：1000－1006.

［8］ GENTLE M J.Cutaneous sensory afferents recorded from the nervus intramandibularis of Gallus gallus var domesticus［J］.Comparative Physiology A，1989，164：763－774.

［9］ XU X G，YANG Z F，HUANG S H，et al.Promotive effects of GABA on acid secretion from isolated mouse stomach in vitro［J］.Acta Zoologica Sinica，2001，47：170－175.

［10］ ZAKUSOV W，OATROVSKAYA R U，BULAYEV V M.GABA－opiates interactions in the activity of analgesics［J］.Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie，1983，265：61－75.

［11］ CHERUBINI E，GAIARSA J L，BEN－ARI Y.GABA：an excitatory transmitter in early postnatal life［J］.Trends in Neurosciences，1991，12：515－519.

［12］ FAN Z Y，DENG J P，LIU G H，et al.Effects ofγaminobutyric acid on the performance and internal hormone levels in growing pigs［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2007，19（4）：350－356.

［13］ PIGUERAS L，VICENTE M.Peripheral GABA－β agonists stimulate gastric acid secretion in mice［J］.British Journal of Pharmacology，2004，142：1038－1048.

［14］ KATO S，ARAKI H，KAWAUCHI S.Body temperature dependence in baclofen－induced gastric acid secretion in rats relation to capsaicin sensitive affront neurons［J］.Life Sciences，2001，68：1951－1963.

［15］ SHUYE P U，JAIN M R，HORVATH T L.Interactions between neuropeptide Y and γ－ammobutyric acid in stimulation of feeding：a morphological and pharmacological analysls［J］.Endocrinology，1999，140：933－940.

［16］ KHANSARI D N，MURGO A J，F(xiàn)AITH R E.Effects of stress on the immune system［J］.Immunol Today，1990，11：170－175.

［17］ CUNHA F Q，F(xiàn)ERREIRA S H.Peripheral hyperalgesic cytokines［J］.Advances in Experimental Medicine and Biology，2003，521：22－39.

［18］ ARRUDA J，SWEITZER L S，RUTKOWSKI M D，et al.Intrathecal anti－IL－6antibody and IgG attenuates peripheral nerve injury－induced mechanical allodynia in the rat：possible immune modulation in neuropathic pain［J］.Brain Research，2000，879：216－225.

［19］ FRISEN J，RISLING M，F(xiàn)RIED K.Distribution and axonal relations of macrophages in a neuroma［J］.Neuroscience，1993，55：1003－1013.

［20］ SPANGELO B L，HORRELL S，GOODWIN A L，et al.Somatostatin and gamma－aminobutyric acid inhibit interleukin－1β－stimulated release of interleukin－6from rat c6glioma cells［J］.Neuroimmunomodulation，2004，11：332－340.

［21］ JOSEPH D，ROACH J D，AGUINALDO G T，et al.γ－aminobutyric acid inhibits synergistic interleukin－6 releases but not transcriptional activation in astrocytoma cells［J］.Neuroimmunomodulation，2008，15：117－124.

［22］ ITOH N，NAGATA S.A novel protein domain required for apoptosis［J］.Biological Chemistry，1993，268：10932－10939.

［23］ WILLIAMS G T，SMITH C A.Molecular of apoptosis：genetic controls on cell death［J］.Cell，1993，74：777－779.

［24］ 胡書超，張建祥.腦出血后的神經(jīng)細胞凋亡機制及治療策略［J］.國外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊，2004，12（7）：524－526.

［25］ XUE M，DELBIGIOL M R.Acute tissue damage after injections of thrombin and plasmin into rat striatum［J］.Stroke，2001，32（9）：2164－2169.

［26］ HOLMIN S，MATHIESAN T.Intracerebral administration of interleukin 1beta and induction of inflammation，apoptosis and vasogenic edema［J］.Neurosurg，2000，92（1）：108－120.

［27］ MAYNE M，NI W，YAN H J，et al.Antisense oligodeoxynucleotide inhibition of tumor necrosis factoralpha expression is neuropotective after intraerbral hemorrhage［J］.Stroke，2001，32（1）：240－248.