劉莉如 楊開(kāi)倫 滑 靜 劉亭婷 王曉霞

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；3.首都師范大學(xué)，北京 100048）

目前，隨著常規(guī)抗生素細(xì)菌抗藥性致病株系的不斷出現(xiàn)，致病菌的抗藥性問(wèn)題已經(jīng)日益嚴(yán)重，造成畜禽機(jī)體免疫力下降，并在畜產(chǎn)品和環(huán)境中大量殘留，從而危害養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、影響人類(lèi)食品安全、抗生素的資源利用和生物生存環(huán)境等，因此，開(kāi)發(fā)綠色安全、高效、無(wú)殘留的抗生素替代品已成為一種必然的趨勢(shì)。天蠶素抗菌肽的宿主原性、天然免疫活性、廣譜抗菌活性和分子質(zhì)量小、作用機(jī)理獨(dú)特等特征賦予其傳統(tǒng)抗生素所不具備的諸多優(yōu)點(diǎn)，有望在解決提高宿主機(jī)體免疫力的同時(shí)帶來(lái)的有害炎癥反應(yīng)和毒副作用等問(wèn)題中發(fā)揮獨(dú)有的重要作用，其作為一種新型的抗生素替代品具有廣闊的應(yīng)用前景。前人對(duì)天蠶素抗菌肽的研究主要集中在分離純化與鑒定以及抗微生物活性等方面，關(guān)于抗菌肽對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能影響的研究很少。關(guān)于飼糧中添加抗菌肽對(duì)蛋用仔公雞相關(guān)細(xì)胞因子基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，目前罕見(jiàn)報(bào)道。在抗生素耐藥性日益增長(zhǎng)的今天，抗菌肽作為新一代抗生素的理想替代者，其在畜禽飼糧中添加效果及適宜添加量有待于進(jìn)一步研究。本文旨在通過(guò)在海蘭褐蛋用仔公雞飼糧中添加不同水平的天蠶素抗菌肽，研究其對(duì)蛋用仔公雞生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)及空腸組織相關(guān)前炎性細(xì)胞因子基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，為進(jìn)一步研究其分子機(jī)理進(jìn)而更好地指導(dǎo)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用天蠶素抗菌肽由國(guó)家飼料工程技術(shù)研究中心研制，北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)所用抗生素為金霉素。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選用336只1日齡健康的海蘭褐蛋用仔公雞（購(gòu)自北京農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院種雞場(chǎng)），平均體重為（39.14±0.17）g，3層籠養(yǎng)，試驗(yàn)雞只自由采食和飲水，其他免疫和消毒措施遵照雞場(chǎng)正常程序進(jìn)行，每天觀察雞群健康狀況，并記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。飼養(yǎng)試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口中試基地雞舍進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

將336只1日齡海蘭褐蛋用仔公雞隨機(jī)分為7組，分別為基礎(chǔ)飼糧組（對(duì)照組）、基礎(chǔ)飼糧＋150 mg／kg金 霉 素 組 （抗 生 素 組）、基 礎(chǔ) 飼 糧 ＋150mg／kg抗菌肽組（抗菌肽Ⅰ組）、基礎(chǔ)飼糧＋200mg／kg抗菌肽組（抗菌肽Ⅱ組）、基礎(chǔ)飼糧＋250mg／kg抗菌肽組（抗菌肽Ⅲ組）、基礎(chǔ)飼糧＋300mg／kg抗菌肽組（抗菌肽Ⅳ組）、基礎(chǔ)飼糧＋350mg／kg抗菌肽組（抗菌肽Ⅴ組），每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞，各處理初始體重差異不顯著（P＞0.05）。飼養(yǎng)試驗(yàn)期為42d。

1.4 試驗(yàn)飼糧

以玉米－豆粕型飼糧為基礎(chǔ)飼糧，按NY／T 33—2004雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.5 生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定

每周進(jìn)行1次結(jié)料，準(zhǔn)確稱(chēng)取飼料重，記錄各重復(fù)蛋用仔公雞的耗料量；分別于試驗(yàn)第1、42天進(jìn)行空腹稱(chēng)重，計(jì)算各重復(fù)的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F／G）。

1.6 免疫器官指數(shù)測(cè)定

于試驗(yàn)第42天清晨，每重復(fù)選取2只雞，準(zhǔn)確稱(chēng)重后，按常規(guī)方法屠宰，取出胸腺、脾臟、法氏囊，并剔除附著的組織，用濾紙吸干血水后進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)（mg／g）＝免疫器官重／體重。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（DM basis） %

1.7 空腸組織中前炎性細(xì)胞因子基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的測(cè)定

1.7.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的雞基因序列設(shè)計(jì)引物（表2），引物由北京優(yōu)博奧生物技術(shù)有限公司合成。1.7.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用超純 RNA提取試劑盒（CWbio.Co.，Ltd.，Cat#CW0581）提取空腸組織樣本中總RNA。對(duì)所提取RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)后，以Chicken ACTB為相對(duì)定量?jī)?nèi)參，以HiFi－MMLV cDNA第1 鏈 合 成 試 劑 盒 （CWbio.Co.，Ltd.，Cat#CW0744）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃10min，（95℃15s，60℃60s）×40個(gè)循環(huán)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for fluorescence－based quantitative real－time PCR

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原始檢測(cè)結(jié)果，按照2－△△Ct相對(duì)定量計(jì)算公式，分析各樣品前炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素－6（IL－6）、干擾素－γ（IFN－γ）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel軟件對(duì)各重復(fù)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 17.0軟件ANOVA進(jìn)行顯著性分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。測(cè)定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA凝膠電泳圖

取5μL RNA，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。由圖1的RNA凝膠電泳圖可清晰地看到18S rRNA、28SrRNA、5SrRNA 的 3 條 帶，且 28S rRNA的亮度約為18SrRNA的2倍，這說(shuō)明所提取的RNA質(zhì)量和完整性良好，可用來(lái)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。

圖1 RNA凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis results of RNA samples

2.2 抗菌肽對(duì)蛋用仔公雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可以看出，在平均日采食量上，抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），但有降低的趨勢(shì)，分別較對(duì)照組降低了4.86%和5.99%；抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），分別比對(duì)照組降低了6.95%、8.00%和9.38%；抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組之間差異不顯著（P＞0.05）。在蛋用仔公雞平均日增重上，各組之間均差異不顯著（P＞0.05）。在料重比上，除對(duì)照組外，其他試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05），試驗(yàn)組中僅抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），分別較對(duì)照組降低了14.46%和16.06%。

2.3 抗菌肽對(duì)蛋用仔公雞免疫器官指數(shù)的影響

由表4可以看出，對(duì)于胸腺指數(shù)的影響，抗生素組及抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），抗菌肽Ⅴ組又顯著高于其他各組（P＜0.05），即各試驗(yàn)組均有提高蛋用仔公雞胸腺指數(shù)的效果，以抗菌肽Ⅴ組提高最多，較對(duì)照組提高了45.41%。

表3 抗菌肽對(duì)蛋用仔公雞生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effects of antimicrobial peptides on growth performance of young roosters for egg production

對(duì)法氏囊指數(shù)的影響，抗菌肽Ⅴ組與對(duì)照組、抗菌肽Ⅰ組差異顯著（P＜0.05），與抗生素組及抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）?？咕蘑踅M的法氏囊指數(shù)提高最多，較對(duì)照組提高了141.21%（P＜0.05）。

對(duì)脾臟指數(shù)的影響，抗菌肽Ⅴ組與抗菌肽Ⅳ組之間差異不顯著（P＞0.05），而顯著高于除抗菌肽Ⅳ組外的其他試驗(yàn)組（P＜0.05），其他各試驗(yàn)組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）?？芍?，抗菌肽Ⅴ組與抗菌肽Ⅳ組提高脾臟指數(shù)的效果較好，分別較對(duì)照組提高了36.57%（P＜0.05）和13.99%（P＞0.05）。

2.4 抗菌肽對(duì)空腸組織中前炎性細(xì)胞因子基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響

由表5可以看出，對(duì)IL－6mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，抗菌肽Ⅰ組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而其余各試驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）?？咕蘑颉ⅱ?、Ⅳ組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），抗菌肽Ⅴ組顯著高低于其他各組（P＜0.05）。也就是說(shuō)，除抗菌肽Ⅰ組外，其他各試驗(yàn)組均能有效降低IL－6mRNA相對(duì)表達(dá)水平，其中以抗菌肽Ⅴ組效果最好，降低了58.75%。

對(duì)IFN－γmRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，抗生素組及抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），但4組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。也就是說(shuō)，除抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組外，其余各試驗(yàn)組均能有效降低IFN－γmRNA相對(duì)表達(dá)水平，且抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組和抗生素組之間效果相當(dāng)，其中抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別較對(duì)照組降低了45.97%、73.25%和75.32%。

對(duì)TNF－αmRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，抗生素組及抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）?？咕蘑?、Ⅴ組顯著低于對(duì)照組和抗菌肽Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.05），其TNF－αmRNA相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組分別降低了21.93%、24.59%。

表5 抗菌肽對(duì)蛋用仔公雞空腸組織中前炎性細(xì)胞因子基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響Table 5 Effects of antimicrobial peptides on mRNA relative expression level of proinflammatory cytokine genes of young roosters for egg production

3 討 論

3.1 抗菌肽對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)的影響

Jaynes［1］發(fā)現(xiàn)一種抗菌肽具有促生長(zhǎng)作用，并在1990年申請(qǐng)了專(zhuān)利。王秀青等［2］的研究表明，用一種天蠶素抗菌肽（cecropin B）替代抗生素飼喂雛雞，可以增加雛雞的平均日增重以及雛雞發(fā)育早期的免疫器官重量，增強(qiáng)雞的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能。楊玉榮等［3］研究了非洲鴕鳥(niǎo)皮膚抗菌肽對(duì)雛雞免疫器官指數(shù)及T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響，結(jié)果表明：飲水中添加濃度為1μg／mL的非洲鴕鳥(niǎo)皮膚抗菌肽可以促進(jìn)雛雞免疫器官發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：飼糧中添加不同水平天蠶素抗菌肽可在不同程度上提高蛋用仔公雞生長(zhǎng)性能和免疫器官指數(shù)，這與之前的研究結(jié)果基本一致。但楊玉榮［4］報(bào)道雞防御素Gal－13（抗菌肽）對(duì)雛雞體重?zé)o顯著影響，這可能是不同抗菌肽對(duì)不同動(dòng)物的影響不一造成的。

3.2 抗菌肽對(duì)雛雞相關(guān)細(xì)胞因子基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響

抗菌肽具有多方面免疫活性，是宿主免疫體系的重要組成部分，對(duì)中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等具有趨化作用，對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)具有減輕或抑制作用［5］。細(xì)胞因子主要包含各種白介素、集落刺激因子（Ⅰ型細(xì)胞因子）和干擾素（Ⅱ型細(xì)胞因子），是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理功能，在機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的過(guò)程中具有十分重要的作用，在對(duì)抗家禽體內(nèi)各種致病菌方面也起著重要作用［6－7］。一些細(xì)胞因子以它們?cè)诟腥竞脱装Y中的作用命名，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的被稱(chēng)為前炎性因子，本文所涉及的細(xì)胞因子IL－6、IFN－γ及 TNF－α皆為前炎性因子，旨在探討添加抗菌肽后對(duì)其基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響。

IL－6是由激活的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞等產(chǎn)生和分泌的一種糖蛋白，體內(nèi)的多種細(xì)胞既能產(chǎn)生和釋放IL－6，受到刺激后也能表達(dá)IL－6基因，因此在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，IL－6水平可反應(yīng)組織損傷程度。IL－6在急性炎癥反應(yīng)中的作用主要表現(xiàn)為對(duì)多種細(xì)胞的促炎作用和誘導(dǎo)肝組織產(chǎn)生急性反應(yīng)蛋白，故克羅恩病活動(dòng)期患者的血清IL－6水平顯著高于健康成人。叢秋霞等［8］對(duì)雞細(xì)胞因子的研究表明：與未接種雞相比，沙門(mén)菌感染雞的異嗜白細(xì)胞中前炎性細(xì)胞因子IL－6的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，同時(shí)雞巨噬細(xì)胞系（HD11）經(jīng)鞭毛蛋白刺激后，前炎性細(xì)胞因子IL－6的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯上調(diào)，說(shuō)明鞭毛蛋白與細(xì)胞相互識(shí)別后，主要引發(fā)的是炎癥反應(yīng)。IFN－γ是一種免疫調(diào)節(jié)的多效性因子，哺乳動(dòng)物和禽體內(nèi)的IFN－γ被用作感染機(jī)體的細(xì)胞介導(dǎo)免疫的指示器，因此通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)雛雞空腸細(xì)胞因子其基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平，可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。TNF－α是一種有效的前炎性細(xì)胞因子，對(duì)各種細(xì)胞類(lèi)型有多效作用，對(duì)各種慢性炎癥的發(fā)病起著關(guān)鍵作用。TNF－α促炎機(jī)制包括觸發(fā)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化以及增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（ECAMs）的表達(dá)。越來(lái)越多的試驗(yàn)研究提示，腸道炎癥的發(fā)生與ECAMs的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)［9－10］。

抗菌肽對(duì)動(dòng)物前炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響在動(dòng)物學(xué)領(lǐng)域尚未見(jiàn)到報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明：飼糧中添加肽生素類(lèi)抗菌肽能有效降低前炎性細(xì)胞因子的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。對(duì)IL－6mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組均能降低其相對(duì)表達(dá)水平，但以抗菌肽Ⅴ組效果最為明顯，即添加量為350mg／kg時(shí)效果最好；對(duì)IFN－γmRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，各抗菌肽組均有下降的趨勢(shì)，但也以350mg／kg添加效果較好；對(duì)TNF－αmRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，僅抗菌肽Ⅳ、Ⅴ組較對(duì)照組顯著下降。這可能是由于飼糧中抗菌肽的添加有效抑制了炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致各前炎性細(xì)胞因子的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低，從而有效提高了機(jī)體免疫力。

4 結(jié) 論

飼糧中添加一定水平的天蠶素抗菌肽能顯著提高蛋用仔公雞生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)，降低IL－6、IFN－γ及TNF－αmRNA的相對(duì)表達(dá)水平，從而有效減輕腸道炎癥的發(fā)生，其中以飼糧添加量為350mg／kg時(shí)效果較好。

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