于靖，翟愛華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

近年來國內(nèi)外研究表明，食物蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的一些短肽具有廣泛的生理調(diào)節(jié)功能[1-3]，特別是具有降壓活性的降壓肽已成為生物活性肽研究領(lǐng)域的重要方面。Oshima等1979年報道了從明膠酶解液中分離提取了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽，這是首次用蛋白酶體外水解食品蛋白獲得ACE抑制肽[4]。上世紀(jì)90年代Hata等研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者每天喝95mL含有纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸（Val-Pro-pro）和氨酸-脯氨酸-脯氨酸（Ile-pro-pro）的酸奶能夠顯著降低血壓，單次口服Val-Pro-pro和Ile-pro-pro也能顯著降低原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的血壓[5]。

目前，ACE抑制肽主要是通過微生物發(fā)酵或蛋白酶水解來生產(chǎn)，此外還有從自溶產(chǎn)物中提取、DNA重組技術(shù)，酸、堿水解法及化學(xué)合成法等[6]。酶法因其成本低、產(chǎn)品安全性高、無副作用等特點，是目前降解蛋白質(zhì)制備ACE抑制肽最主要的生產(chǎn)方式[7]。國內(nèi)外大多以大豆蛋白[8-10]、玉米蛋白[11-13]、雞蛋蛋白[14，15]、膠原蛋白[16-18]等原料制備降血壓肽。米糠是稻米加工過程中主要的副產(chǎn)物，目前主要用于飼料加工和初級產(chǎn)物的提取，造成資源的浪費。米糠蛋白質(zhì)含量在10%以上，且其氨基酸組成接近于人體需要量模式[19]，用米糠蛋白來生產(chǎn)降血壓成本低、安全性高，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。研究選用七種蛋白酶單酶和復(fù)合酶酶解米糠蛋白，通過測定酶解物ACE抑制率及數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法篩選酶，以期獲得具有穩(wěn)定ACE抑制活性的降壓肽，以便為工業(yè)化生產(chǎn)米糠降血壓提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料

米糠蛋白（北大荒希杰食品科技公司），ACE、Hippuryl-His-Leu（美國sigma公司），中性、堿性蛋白酶（西安永屹生物技術(shù)有限公司），木瓜蛋白酶（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），胰、胰凝乳蛋白酶（美國Amresco公司），堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L（丹麥諾維信），蛋白酶K（德國merk），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），AR2140電子天平，（梅特勒-托利多儀器有限公司），LD5-10B低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司），PH-3C pH計（上海安亭雷磁有限公司），DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海森信試驗儀器有限公司），TDS-050冷凍干燥試驗機(jī)（撫順黎明機(jī)械廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠蛋白酶解液的制備

米糠蛋白按一定底物濃度加水配成懸浮液，90℃加熱預(yù)處理10 min，降溫至所需溫度后加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH，恒溫恒pH下攪拌15min待pH穩(wěn)定后加入酶水解（水解過程中不斷加入氫氧化鈉深夜維持pH在規(guī)定范圍的±0.05內(nèi)），反應(yīng)結(jié)束后迅速加熱10min滅酶，離心（4 000 r·min-1，15min），收集上清液備用。

1.2.2 ACE抑制活性的測定方法

試驗選用黎觀紅建立的體外測定方法[7]并進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整來測定ACE抑制活性，此方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性較好。方法如下：將ACE底物HHL溶于0.1 mol·L-1的含0.3 mol·L-1NaCl的硼酸鹽緩沖液中（pH 8.3），配制成5 mol·L-1的濃度。取50μL 5 mol·L-1HHL溶液與20μL ACE抑制劑混合，在37℃恒溫水浴中預(yù)熱5min，隨后加入10μL 0.1 U·mL-1ACE溶液，37℃反應(yīng) 30 min。加入100μL 1mol·L-1HCl溶液終止反應(yīng)，并加入蒸餾水至0.5mL。在避光條件下加入0.6 mL喹啉，旋渦器上混合10 s后加入0.2 mL苯磺酰氯（BSC），立即蓋緊離心管管塞在旋渦混合器上混合20 s，反應(yīng)液在30℃恒溫水浴鍋中避光放置30min。隨后向管中加入3.7mL無水乙醇，混勻，繼續(xù)避光放置30min。用紫外-可見分光光度計測定波長492 nm的吸光值，計算ACE抑制程度。計算公式如下：

式中：Aa——ACE及ACE抑制劑都存在的條件下的吸光度；

Ab——ACE抑制劑不參與反應(yīng)的條件下測得的吸光度；

Ac——ACE不參與反應(yīng)的條件下的吸光度。

1.2.3 單酶篩選的研究

根據(jù)各種蛋白酶水解的特異性不同，試驗分別選取了堿性蛋白酶、堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K等七種蛋白酶進(jìn)行水解，在各種酶的最適酶解條件下（各酶合適的pH和溫度下），以底物濃度為3%，酶用量為3 000 U·g-1，時間為6 h進(jìn)行試驗，通過測定ACE抑制率和水解度篩選出適合于米糠蛋白酶解的最適用酶。

1.2.4 復(fù)合酶篩選的研究

選取ACE抑制活性較強(qiáng)的酶按比例（1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1）進(jìn)行兩兩組合，復(fù)合后總的酶活力為3 000 U·g-1，配制3%米糠蛋白溶液，在100℃熱處理10 min先加入第一種酶作用2 h后，滅酶后調(diào)至第二種酶的適宜條件，繼續(xù)水解2 h在100℃條件下熱處理10min使酶失活，4 000 r·min-1離心15min取上清液進(jìn)行冷凍干燥（干燥倉壓力5 Pa，凍結(jié)溫度-30℃，冷阱溫度-50℃，干燥終點20℃），取干燥粉末溶解后測定ACE抑制活性。

1.2.5 最佳水解用酶的研究

把單酶和復(fù)合酶作用下較高的ACE抑制活性進(jìn)行比較，通過差異顯著性分析得到最佳的水解用酶。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SAS8.2軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4 米糠蛋白常規(guī)指標(biāo)

蛋白質(zhì)含量的測定（參照GB/T 5009.5-2010）；

灰份的測定（參照GB/T 5009.4-2010）；

水分的測定（參照GB/T 5009.3-2010）；

粗脂肪的測定（參照GB/T5009.6-2003）。

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠蛋白常規(guī)指標(biāo)

米糠蛋白中各組分含量見表1。

表1 米糠蛋白的成分分析結(jié)果Table 1 Rice bran protein componentanalysis result

2.2 單酶篩選的研究

七種單酶分別水解6 h，在1、2、3、4、5、6 h六個不同的時間點取樣，測得降血壓肽的ACE抑制率各不相同，見圖1。

圖1 單酶作用下降壓肽的ACE抑制率Fig.1 ACE inhibition rate under single enzyme action of pressure drop peptide

米糠蛋白在堿性蛋白酶、堿性蛋白酶Alcalase、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K各酶最適條件下酶解，隨著各酶作用時間的延長，降血壓活性先迅速升高，隨著時間的延長，活性開始降低。水解蛋白酶Alcalase作用下得到的降壓肽的ACE抑制率最高，達(dá)到71.1%。

酶解程度即水解度的大小對肽段長度、游離氨基酸的相對含量和產(chǎn)物ACE抑制活性至關(guān)重要。酶解程度不夠，具有ACE抑制活性的氨基酸殘基不能暴露出來，則顯示不出ACE抑制活性；如果酶解程度太大，產(chǎn)物中的游離氨基酸相對含量增加，具有ACE抑制率的肽段被進(jìn)一步水解，而破壞了其具有ACE抑制活性的肽段結(jié)構(gòu)上的完整特征，ACE抑制活性因此也不高。

2.3 復(fù)合酶篩選的研究

通過單酶篩選實驗，選取ACE抑制率較高的堿性蛋白酶Alcalase、中性蛋白酶和堿性蛋白酶三種酶進(jìn)行復(fù)合酶篩選研究。復(fù)合酶在不同的比例下水解米糠蛋白，得到降血壓肽的ACE抑制活性與其在單一的酶作用下的ACE抑制活性有所不同，結(jié)果見表2。

表2 不同復(fù)合酶組合及配比下降壓肽的ACE抑制活性Table 2 ACE inhibited activity of different composite enzyme combination and ratio of antihypertensive peptide

由表2可知，酶在不同的復(fù)合比例條件下酶解米糠蛋白得到降血肽的ACE抑制活性各不相同。試驗的目的是選取最佳的酶，每組復(fù)合酶水解4 h時有最大ACE抑制活性，對其進(jìn)行差異顯著性分析，其結(jié)果見表3。

由表3差異顯著性分析可知，酶復(fù)合后各組的ACE抑制率均顯著，水解蛋白酶Alcalase和中性蛋白酶組合（3∶1）的ACE抑制率顯著高于水解蛋白酶Alcalase（3∶1）和堿性蛋白酶組合及堿性蛋白酶和中性蛋白酶組合。因此復(fù)合酶中優(yōu)先選擇水解蛋白酶Alcalase和中性蛋白酶（3∶1）組合。

表3 復(fù)合酶對ACE抑制活性的比較Table 3 ACE inhibitory activity of different composite enzyme

2.4 單酶和復(fù)合酶對ACE抑制活性的比較

把單酶作用下的最佳ACE抑制率和復(fù)合酶作用下最佳的ACE抑制率，通過差異顯著性分析得到水解最佳用酶，其結(jié)果見表4。

表4 不同蛋白酶作用下降壓肽ACE抑制活性的比較Table 4 ACE inhibited activity of different protease function antihypertensive peptide

由表4的差異顯著性分析可以看出，復(fù)合酶的ACE抑制率與水解蛋白酶Alcalase單獨作用時相比較，差異顯著。這可能是由于中性蛋白酶作為第二步水解用酶，進(jìn)一步將有活性的肽段水解為無活性的肽段，而導(dǎo)致復(fù)合酶水解后ACE抑制活性反而降低。

綜合考慮，單酶及復(fù)合酶酶解米糠蛋白的酶解物ACE抑制活性，堿性蛋白酶Alcalase進(jìn)行水解得到的肽段具有較高的ACE抑制活性，因此試驗選取堿性蛋白酶Alcalase為水解用酶。

3 結(jié)論

3.1 米糠蛋白在酶的水解作用下得到的酶解物具有ACE抑制活性，不同的蛋白酶及其配比條件下得到的酶解物的ACE抑制活性各不同。

3.2 堿性蛋白酶Alcalase水解得到的ACE抑制活性最高，在2 h達(dá)到最大，為71.1%。

3.3 復(fù)合酶水解米糠蛋白4 h時，水解蛋白酶Alcalase與中性蛋白酶在3∶1的條件下ACE抑制率達(dá)到最高，達(dá)到61.10%。

3.4 通過單酶和復(fù)合酶的差異顯著性分析，篩選出水解蛋白酶Alcalase為最佳水解用酶。

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