李士龍，陳明霞，3，田雪嬌，張麗萍，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心；3.大慶油田技術(shù)培訓(xùn)中心）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）即2-羥基-3-苯基丙酸[1]，是近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)的乳酸菌代謝產(chǎn)生的一種新型抑菌物質(zhì)，抑菌譜廣，具有較好溶解性、熱穩(wěn)定性[2]。苯乳酸可由多種微生物產(chǎn)生，早期研究的是乳糖發(fā)酵短桿菌[3]，近幾年研究的主要有乳酸菌，霉菌[4]，溶血葡萄球菌[5]等，但是這些菌株的苯乳酸產(chǎn)量很低。Lavermicocca（2000年）[6]從酸面團(tuán)中分離到的L.plantarum 21B，產(chǎn)苯乳酸量為0.056 g·L-1，這是關(guān)于乳酸菌產(chǎn)生苯乳酸的首次報(bào)道，隨后相繼獲得多株乳酸菌，但產(chǎn)苯乳酸的菌株間差異較大，最高為0.099 g·L-1。張莉力[7]、柴虹宇[8]等人從傳統(tǒng)發(fā)酵制品中分離得到苯乳酸產(chǎn)量為0.081 g·L-1的植物乳桿菌，通過(guò)紫外線誘變后，苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到0.528 g·L-1。李興峰（2007年）[9-10]等從中國(guó)傳統(tǒng)食品泡菜中，篩選得到一株植物乳桿菌SK007，苯乳酸的產(chǎn)量可達(dá)0.091 g·L-1，在MRS培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵培養(yǎng)基下，3 g·L-1苯丙酮酸24 h后轉(zhuǎn)化生成2.1 g·L-1左右的苯乳酸，此為目前世界上乳酸菌中產(chǎn)苯乳酸量最高的菌株。由此可知，苯乳酸生產(chǎn)菌及其生產(chǎn)能力還有挖掘潛力，要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)苯乳酸，必須要有高產(chǎn)苯乳酸的菌種。試驗(yàn)以篩選自本國(guó)、本地區(qū)的自然發(fā)酵物中的高產(chǎn)苯乳酸菌株Lactobacillus plantarum LY-78（苯乳酸初始產(chǎn)量為0.246 g·L-1）為出發(fā)菌株，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以便為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

Lactobacillus plantarum LY-78（GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)JN222930），由課題組篩選保存。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

酵母粉5 g·L-1，牛肉膏10 g·L-1，葡萄糖5 g·L-1，磷酸氫二鉀2 g·L-1，乙酸鈉5 g·L-1，吐溫-80 8mL·L-1，磷酸氫二鉀 2 g·L-1，乙酸鈉5 g·L-1，檸檬酸二銨2 g·L-1，硫酸鎂0.58 g·L-1，硫酸錳0.25 g·L-1，pH調(diào)至6.2～6.4。

1.1.3 主要儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（Agilent科技公司），BCN-1360型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司），SPH-250型生化培養(yǎng)箱（上海森信試驗(yàn)儀器有限公司），TGL-16B型高速離心機(jī)（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），HZQ-QX全溫振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。苯乳酸標(biāo)品（Sigma公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苯乳酸含量測(cè)定方法

取發(fā)酵液10mL，加20mL無(wú)水乙醇，5 000 r·min-1離心15min，取上清液，95℃水浴40 min，分別用10mL乙醚常溫萃取2次，合并2次萃取液，50℃蒸干，用甲醇溶解定容至10mL，冰箱冷藏備用[7]。

采用沐萬(wàn)孟等[11]的方法進(jìn)行苯乳酸含量測(cè)定。流動(dòng)相A為0.5 g·L-1三氟乙酸水溶液，B為乙腈溶液；洗脫程序是0～20min為10%～100%B，20～23 min保持100%B；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫30℃；流速1 mL；進(jìn)樣量10μL。

1.2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響苯乳酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因子

以Lactobacillus plantarum LY-78為出發(fā)菌株，采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，即發(fā)酵時(shí)間74 h，接種量7%，發(fā)酵溫度35℃，pH 8，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，裝液量150 mL/250 mL，種齡10 h，以苯乳酸的產(chǎn)量作為響應(yīng)值Y，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12]，選擇培養(yǎng)條件中的7個(gè)因素作為研究對(duì)象，即酵母膏（X1）、葡萄糖（X2）、蛋白胨（X4）、碳酸鈣（X6）、苯丙氨酸（X7）、牛肉膏（X8）、和吐溫-80（X9），另外選擇2個(gè)虛擬變量，用來(lái)估算誤差。試驗(yàn)選用9因素，N=12次的試驗(yàn)表格，篩選出3個(gè)主效應(yīng)影響因子。

1.2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)逼近關(guān)鍵因素的最優(yōu)水平

根據(jù)Plackett-Bunnan試驗(yàn)確定的3個(gè)重要因素設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，檢測(cè)苯乳酸含量，以確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

1.2.2.3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響合成苯乳酸的3個(gè)主要因素為自變量，以苯乳酸產(chǎn)量為考察指標(biāo)，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，以確定最優(yōu)培養(yǎng)條件。

1.2.2.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SAS8.2軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸和圖形分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯乳酸產(chǎn)量影響因子的評(píng)價(jià)

按照表1給出的變量取值，通過(guò) Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果利用SAS軟件進(jìn)行分析，顯示結(jié)果見(jiàn)表1。

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它可以在多個(gè)因素中快速選出最重要的幾個(gè)因素。每個(gè)因素取兩個(gè)水平：低水平記為-1，高水平取低水平的1.25倍左右，記為1[13-15]。由表可知，葡萄糖、苯丙氨酸、吐溫-80添加量在7個(gè)考察因素中顯著性最高。葡萄糖是用來(lái)構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中碳架來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為機(jī)體提供維持生命活動(dòng)所需的能源，是微生物生長(zhǎng)需要量最大的營(yíng)養(yǎng)物；苯丙氨酸是合成苯乳酸的前體物質(zhì)，苯丙氨酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成苯丙酮酸，進(jìn)一步在脫氫酶的作用下生成苯乳酸；表面活性劑吐溫-80可以刺激苯乳酸的產(chǎn)生，幫助苯乳酸很好的擴(kuò)散，這或許是由于吐溫-80起了阻止苯乳酸吸附到細(xì)胞表面和玻璃器皿表面的作用。所以選這3個(gè)因素作為重要因素，進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。另外4個(gè)因素根據(jù)效應(yīng)性選擇試驗(yàn)水平，即蛋白胨（X3）選擇低水平，酵母膏（X1）、牛肉膏（X8）、碳酸鈣（X5）選擇高水平。

使用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，主要因素的編碼多元一次回歸方程為：

一次多項(xiàng)式擬合的相關(guān)系數(shù)R2值為97.25%，回歸模型相關(guān)度也較為顯著（p＜0.05）。這些結(jié)果表明該模型解釋了Plackett-Burman試驗(yàn)中97.25%的數(shù)據(jù)。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman experimental design plan and results

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Steepestascentexperimental design

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)找到顯著因素分別為葡萄糖、苯丙氨酸和吐溫-80，且葡萄糖和酵母膏為正效應(yīng)，吐溫-80為負(fù)效應(yīng)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果所顯示的正負(fù)效應(yīng)確定因素水平增加或減少，結(jié)合試驗(yàn)的實(shí)際情況，設(shè)計(jì)三個(gè)因素的變化方向和步長(zhǎng)。以葡萄糖每次增加5 g、苯丙氨酸每次增加2 g、吐溫-80每次減少1mL為基本步長(zhǎng)，最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。找到苯乳酸產(chǎn)量最大的試驗(yàn)處理，即為響應(yīng)面分析法的中心點(diǎn)。

由表4可知，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基在No.3和No.5之間，所以用No.4條件作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)及分析

2.3.1 響應(yīng)曲面模型的建立及回歸分析檢驗(yàn)

以Plackett-Burman設(shè)計(jì)的結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以苯乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值Y，選取第4組的添加量作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的零水平，對(duì)葡萄糖、苯丙氨酸和吐溫-80這3個(gè)因素運(yùn)用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化，試驗(yàn)因子的編碼值、試驗(yàn)安排和結(jié)果見(jiàn)表3。

15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類(lèi)：一是析因點(diǎn)，自變量取值在其所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共12個(gè)析因點(diǎn)；二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，用以估算試驗(yàn)誤差[16-18]。以苯乳酸的產(chǎn)量為響應(yīng)值，利用SAS軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到關(guān)于苯乳酸產(chǎn)量（Y）對(duì)發(fā)酵時(shí)間（X1）、接種量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）的多元回歸方程：

表3 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方案及結(jié)果Table 3 The test program and results of central composite design

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regressionmodel

從方差分析結(jié)果可以看出，此試驗(yàn)得到的模型回歸顯著性p＜0.01，試驗(yàn)選用的二次多項(xiàng)模型具有高度顯著性，失擬項(xiàng)p＞0.05，說(shuō)明數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。用以評(píng)價(jià)回歸模型擬合度的R2值為96.08%，說(shuō)明苯乳酸產(chǎn)量的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值具有較高的擬合度，試驗(yàn)的誤差較小，方程代表的模型適合于模擬此發(fā)酵過(guò)程，可以用于試驗(yàn)結(jié)果的分析和預(yù)測(cè)。

表5 響應(yīng)面二次多項(xiàng)式方差分析結(jié)果Table 5 Quadratic polynomial response surface analysis of variance results

2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面分析及條件優(yōu)化

圖1 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面和等高線分析圖Fig.1 Y=f（X2，X3），response surface and contour analysis diagram

圖1是由多元回歸方程式所做的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，由此可對(duì)X2，X3兩因素交互影響進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，以確定最佳因素水平范圍。顯示了當(dāng)葡萄糖添加量處于中心點(diǎn)水平值20 g·L-1時(shí)，苯丙氨酸添加量和吐溫-80添加量對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的交互作用影響，由圖可直觀看出兩者的交互作用比較顯著，此結(jié)果與方差分析相一致。當(dāng)苯丙氨酸添加量于較低或較高值時(shí)，吐溫-80添加量的增加對(duì)其抑菌活性的影響不大，但當(dāng)苯丙氨酸添加量位于13 g·L-1附近時(shí)，隨著吐溫-80添加量的增加，苯乳酸產(chǎn)量快速增加，并在一定范圍內(nèi)達(dá)到最大值，兩者變現(xiàn)出一定的協(xié)同作用，但超出了一定范圍，苯乳酸產(chǎn)量則呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)勢(shì)態(tài)。這同時(shí)也說(shuō)明苯丙氨酸添加量對(duì)響應(yīng)值影響十分顯著。

由圖1可知，該回歸方程存在極大值點(diǎn)。該組圖對(duì)X2，X3兩個(gè)主效應(yīng)因子對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的交互作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。根據(jù)回歸方程，可得到最佳因素編碼：X1=23.981 4，X2=12.991 19，X3=7.403 544，最佳點(diǎn)時(shí)的Y值為2.222 674?？紤]到實(shí)際情況即葡萄糖添加量為24 g·L-1，苯丙氨酸添加量為13 g·L-1，吐溫-80添加量為7.4mL·L-1，苯乳酸產(chǎn)量理論值為2.22 g·L-1。

為檢驗(yàn)試驗(yàn)的可靠性，采用上述最佳發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行苯乳酸發(fā)酵試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)5次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際得到的苯乳酸產(chǎn)量的平均值為2.13 g·L-1，與理論預(yù)測(cè)值2.22 g·L-1的相對(duì)誤差小于5%，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，響應(yīng)面分析所得到的優(yōu)化模型是可靠的，表明該數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化苯乳酸發(fā)酵工藝條件是可行的，可真實(shí)的反應(yīng)各因素對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響，具有實(shí)用價(jià)值。

3 討論

發(fā)酵培養(yǎng)基的變化對(duì)產(chǎn)苯乳酸的菌株有很大的影響[10，13，16]，因此，對(duì)苯乳酸發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化具有重要的意義。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法基于不完全平衡塊原理，可以利用最少的試驗(yàn)次數(shù)，從眾多的考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因子；Box-Behnken設(shè)計(jì)法在先逼近最大響應(yīng)區(qū)域后建立連續(xù)變量曲面模型和回歸方程，并能對(duì)影響因變量的各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，可快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件[19-21]，綜合運(yùn)用兩種方法對(duì)Lactobacillus plantarum LY-78發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究，結(jié)果表明在各因素分別為葡萄糖24 g·L-1，苯丙氨酸13 g·L-1，吐溫-80 7.4 mL·L-1、酵母膏6.25 g·L-1、牛肉膏12.5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、碳酸鈣12.5 g·L-1，培養(yǎng)基其他成分不變時(shí)，5次驗(yàn)證試驗(yàn)苯乳酸產(chǎn)量2.13 g·L-1，與未優(yōu)化前的0.246 g·L-1相比，產(chǎn)量提高了7.65倍。

［1］祁國(guó)榮，袁士龍.關(guān)于征求《生物化學(xué)與分子生物學(xué)名詞》修正意見(jiàn)的說(shuō)明：續(xù)［J］.生命的化學(xué)，2006，26（1）：72-88.

［2］Dieuleveux V，Lemarinier S，Gueguen M.Antimicrobial spectrum and target site of D-3-pheyllactic acid［J］.International Journal of Food Microbiology，1998，40（3）：177-183.

［3］Kamata M，Toyomasu R，Suzuki D，et al.D-phenyllactic acid production by Brevibacterium or Corynebacterium：JP，86108396［P］.1986-1991.

［4］Dieuleveux V，der Van P，Chataud J，et al.Purification and characterization of anti-Listeria compounds produced by Geotrichum candidum［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64（2）：800-803.

［5］李德茂.生物還原苯丙酮酸制備單一對(duì)映體3-苯基乳酸的研究［D］.儋州：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［6］Vermeulen N，Ganzle MG，Vogel RF.Influence of peptide supply and co substrates on phenylalanine metabolism of Lactobacillus sanfranciscensis DSM2045lT and Lactobacillus plant arum YMW l.468 ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry.2006，54（11）：3832-3839.

［7］張莉力，柴虹宇.產(chǎn)苯乳酸乳酸菌的篩選及鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，38（5）：2590-2592.

［8］柴虹宇，張莉力，王玉田.苯乳酸高產(chǎn)菌株的誘變育種［J］.食品工業(yè)科技，2010（8）：154-156.

［9］Xingfeng Li，Bo Jiang，Beilei Pan.Biotransformation of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by growing and resting cells of a Lactobacillus sp.［J］.Biotechnology Letters，2007，29：593-597.

［10］李興峰，江波，潘蓓蕾，等.苯丙氨酸及苯丙酮酸對(duì)lactobacillus sp.SK007合成苯乳酸的影響［J］.過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2007，7（6）：1202-1206.

［11］沐萬(wàn)孟，周宏敏，劉鳳麗，等.苯乳酸的快速檢測(cè)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（11）：135-137.

［12］Haaland PD.Experimental Design in Biotechnology［M］.New York：Marcel Dekker Inc，1989.

［13］李銀鏑.D-乳酸高產(chǎn)菌株的選育、發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及代謝通量分析［D］.天津：天津大學(xué)，2007.

［14］付世新，李曉龍，王長(zhǎng)遠(yuǎn)，等.不同培養(yǎng)基對(duì)PK15細(xì)胞增殖影響的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，16（1）：62-64.

［15］胡運(yùn)權(quán).試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法［M］.哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社，1997.

［16］胡永紅，沈樹(shù)寶，歐陽(yáng)平凱.響應(yīng)面分析法用于微生物培養(yǎng)基濃度的優(yōu)化［J］.工業(yè)微生物，2002，32：9-12.

［17］盛艷，高玉榮.產(chǎn)廣譜細(xì)菌素米酒乳桿菌C2發(fā)酵培養(yǎng)基的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，21（4）：76-80.

［18］江元翔，高淑紅，陳氏華.響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化腺普發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，31（3）：309-313.

［19］張鴻雁，王偉英.堿性蛋白酶產(chǎn)生菌S9發(fā)酵條件的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，19（6）：58-61.

［20］Ratnam BVV，Rao M Narasimha，et al.Optimisation of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch using response surfacemethodology［J］.World Journal of Microbiology&Biotechnology，2003，19：523-526.

［21］Ambat P，Awanna C.Optimisation medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using responsesurface methods［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2001，17：331-335.