劉自剛，呼天明，汪玉琳，王新軍，楊亞麗，張 雁，何 軍，雷燕妮

(1.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥工程系，陜西 商洛 726000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

桔梗(Platycodongrandiflorum)為桔?？平酃?，是一種藥、食、賞兼用的多年生雙子葉草本植物。豐富的種質(zhì)資源是進(jìn)行遺傳研究和種質(zhì)改良的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有特異性狀桔梗種質(zhì)的鑒定及其遺傳信息的占有是科學(xué)開展良種培育的前提，隨著桔梗種質(zhì)觀察研究的不斷深入，一些新的種質(zhì)類型不斷被發(fā)現(xiàn)[1]。

在高等植物中雄性不育是一種很普遍的遺傳現(xiàn)象，到目前為止已在43科162屬297種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育的存在[2-6]。植物雄性不育性是特殊的育種目標(biāo)性狀，通過雄性不育系進(jìn)行雜交制種利用雜種優(yōu)勢(shì)已成為許多異花乃至自花授粉植物的主要育種方向[7-8]。目前對(duì)桔梗雄性不育的相關(guān)報(bào)道較少，僅有魏建和[9]、吳日基等[10]、王志芬等[11]、劉自剛等[12]各自在不同群體中先后發(fā)現(xiàn)并鑒定了桔梗雄性不育突變體并對(duì)其進(jìn)行了初步研究，魏建和[9]還對(duì)桔梗雄性不育發(fā)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)理、遺傳特性等進(jìn)行了初步探討，但尚未見桔梗雄性不育穩(wěn)定性方面的相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)桔梗不育種質(zhì)從生殖結(jié)實(shí)特性、育性穩(wěn)定性等方面進(jìn)行研究，以期為桔梗育性特異種質(zhì)的進(jìn)一步發(fā)掘和雜種優(yōu)勢(shì)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 2006年7月在進(jìn)行桔梗去雄雜交、套袋自交的過程中，在當(dāng)?shù)厣L2年的桔梗栽培群體中發(fā)現(xiàn)了1株雄性不育單株。隨后在種質(zhì)資源圃及大田中，對(duì)桔梗花器形態(tài)結(jié)構(gòu)展開了大量的田間觀察和花粉活力的鑒定，又相繼發(fā)現(xiàn)了桔梗不育材料14株，并編號(hào)為PA1～PA14。PF、PCF、ZB分別為商洛、赤峰、淄博栽培種中篩選的可育單株。

1.2方法

1.2.1不育花形態(tài)結(jié)構(gòu)及傳粉生物學(xué)研究 對(duì)不育花花器結(jié)構(gòu)、柱頭運(yùn)動(dòng)、單花花粉量、胚珠數(shù)、不育花結(jié)實(shí)率，不育株系開花物候期，傳粉昆蟲的種類和行為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)觀察；胚珠活性采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)測(cè)定，花粉活力采用I2-KI 染色法測(cè)定，不育花結(jié)實(shí)特性采用人工授粉法，授粉后套袋掛牌標(biāo)記，成熟后統(tǒng)計(jì)結(jié)果率和結(jié)籽率，以衡量柱頭壽命。

單花花粉量測(cè)定方法：分別隨機(jī)選取即將開放的花蕾(花藥未開裂)各10朵，每株采1朵，固定于FAA中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。從花中取下花藥，用1.0 mL·L-1HCl軟化花粉壁。然后細(xì)心的解剖花藥，將花粉全部移入1個(gè)有刻度的離心管，用蒸餾水定容至4 mL。在振蕩器上震蕩2 min后，用移液槍吸取1 μL的花粉液于載玻片上，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)，每個(gè)花藥重復(fù)5次；花粉/胚珠比率(P/O)用其花藥中的花粉數(shù)除以其子房中的胚珠數(shù)得出。

1.2.2不育株結(jié)實(shí)率鑒定 于花期對(duì)篩選的12個(gè)不育單株材料，分別進(jìn)行人工授粉、套袋自交和自然授粉3種處理，并掛牌標(biāo)記，處理后10 d除去套袋；在研究中發(fā)現(xiàn)桔梗具有自交不親性，且主要由雌雄蕊異熟和花后柱頭絨毛隔離花粉造成的。因此，采用延遲授粉的方式進(jìn)行人工授粉，即花前1 d套袋，套袋后3 d再人工授以新鮮花粉；種子成熟后統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率、結(jié)籽率。

1.2.3桔梗不育性對(duì)溫度的反應(yīng) 將同一不育株材料的無性繁殖后代單株，分別培養(yǎng)于相同規(guī)格的兩個(gè)培養(yǎng)盆中，花芽分化期將一盆放置于人工氣候箱內(nèi)，設(shè)置箱內(nèi)溫度比同期室外溫度低4～6 ℃；另一盆放置于室外自然環(huán)境，保持室內(nèi)外溫差在開花后進(jìn)行育性鑒定。

1.2.4桔梗不育性對(duì)光照的反應(yīng) 盆栽采用植盆規(guī)格為25 cm×20 cm、裝土量及盆土養(yǎng)分一致。材料為敗育徹底單株P(guān)A14的無性繁殖后代；光照長度控制采用遮光處理縮短光長、人工補(bǔ)光延長光長，中斷暗期處理在人工氣候箱中進(jìn)行。于花芽分化期進(jìn)行光照處理，暗棚遮光(雙層黑布罩)處理設(shè)3個(gè)日長，分別為9、12和15 h·d-1；中斷暗期處理為每天00：00人工光照1 h。開花后鑒定不育性變化情況。

1.2.5環(huán)境對(duì)桔梗不育性的影響 選用桔梗雄性不育株的無性繁殖后代分別在3個(gè)不同緯度的地區(qū)(云南昆明、陜西商洛、山西代縣)定植，于花期觀察育性表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)花粉量、花粉敗育率。

1.2.6主要營養(yǎng)元素對(duì)桔梗育性的影響 將桔梗不育株系分別定植于紅壤、沙質(zhì)土、黃土3種不同質(zhì)地土壤中，土壤肥力情況見表1。于花期觀察育性表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)花粉量、花粉敗育率。

表1 不同土壤類型的化學(xué)性狀

1.2.7不育性遺傳特性研究 用不育材料和來源不同的桔?？捎龁沃杲M配，于花期調(diào)查花期觀察育性表現(xiàn)，并調(diào)查不育株數(shù)，計(jì)算不育株率，統(tǒng)計(jì)育性表現(xiàn)情況。

1.3數(shù)據(jù)分析 利用SPSS軟件和Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1桔梗不育花形態(tài)結(jié)構(gòu)及生殖特性研究

2.1.1花形態(tài)特征 桔梗不育花花冠大小、花瓣顏色、子房大小與相同來源的可育花相比沒有明顯差異；但不育花柱頭比可育花略大，色澤也較深為藍(lán)色，柱頭外被白色絨毛，無或少有花粉附著；花藥干癟萎縮為灰褐色，與柱頭相離，寬僅為可育花花藥的1/3，長為2/3左右(圖1)。

圖1 桔梗不育花、正常花、正?；ǚ奂暗鋽』ǚ坌螒B(tài)

2.1.2花粉量、胚珠數(shù)和花粉胚珠活性 桔?？捎▎位ɑǚ哿繛?46 880，胚珠數(shù)197.6枚，P/O較高，為743.3(表2)；可育花粉經(jīng)I2-KI 染色均勻且為褐色，花粉粒正五邊形或正六邊形；胚珠與TTC反應(yīng)被染成深紅色，具有較高活性。桔梗不育單株P(guān)A1、PA3、PA4、PA5、PA6、PA7、PA9 和PA11有微量花粉產(chǎn)生，染色鏡檢后發(fā)現(xiàn)花粉外形呈不規(guī)則狀，不能被I2-KI 染色，為敗育花粉，其余不育單株花藥中無花粉產(chǎn)生；不育花單花平均有胚珠203.4枚，比可育花略多，發(fā)育正常，且活性與可育花胚珠相當(dāng)。

表2 桔梗不育花和可育花單花花粉量、胚珠數(shù)比較

2.1.3不育花結(jié)實(shí)率 桔梗不育花與正常花異花授粉和自花授粉結(jié)果率、結(jié)籽率和親和指數(shù)均較高，不育花與相同來源的可育花在結(jié)實(shí)性上無明顯差異；不育花自交不能結(jié)籽，桔梗不育花花粉無授粉活力，表明不育花雌蕊正?？捎廴锊挥l(fā)現(xiàn)的桔梗不育單株確為雄性不育突變材料(表3)。

另外，自花授粉和異花授粉兩種處理，均選用開花后3 d已開裂柱頭授以自花花粉(同一植株花朵花粉)或異花花粉(不同植株花朵花粉)的方法，研究結(jié)果顯示，桔梗自交和異交結(jié)籽率、親和指數(shù)均較高，兩種授粉方式在結(jié)實(shí)能力方面無明顯差異(表3)，表明延遲3 d授粉是克服桔梗人工授粉結(jié)實(shí)率低的有效途徑。

2.2桔梗雄性不育穩(wěn)定性研究

2.2.1栽培地對(duì)不育性穩(wěn)定性的影響 選用同一桔梗雄性不育株的無性繁殖后代、可育單株P(guān)CF1、PCF2分別在3個(gè)不同緯度的地區(qū)(云南昆明、陜西商洛、山西代縣)定植，于花期統(tǒng)計(jì)育性表現(xiàn)(表4)。桔梗不育單株P(guān)A4敗育徹底，在不同栽培地不育性表現(xiàn)穩(wěn)定；不育株P(guān)A5在不同栽培地花粉量略有所變化，表明桔梗徹底敗育單株不育性很少受環(huán)境影響，而微量花粉單株其花粉量在一定范圍內(nèi)受環(huán)境的修飾。

表3 桔梗不育花與可育花結(jié)實(shí)比較

表4 不同栽培地對(duì)不育性穩(wěn)定性的影響

表5 不同土壤肥力對(duì)育性表現(xiàn)的影響

2.2.2土壤肥力對(duì)不育性穩(wěn)定性的影響 不同類型的土壤肥力各指標(biāo)均不相同，其中以紅壤肥力較高，沙質(zhì)土肥力中等，黃土肥力最低(表1)。將同一桔梗單株的無性繁殖后代栽培于化學(xué)性狀不同的土壤中，在不同土壤肥力栽培條件下，桔梗不育株和可育株單花花粉量均無明顯變化(表5)。表明土壤肥力對(duì)桔梗不育株花粉量的形成無明顯影響，土壤肥力對(duì)桔梗不育穩(wěn)定性無明顯作用。

2.2.3不育性在年際間的表現(xiàn) 在商洛地區(qū)2006-2008年對(duì)桔梗徹底敗育單株P(guān)A4和微量花粉單株P(guān)A5進(jìn)行連續(xù)3年的育性調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，不育單株P(guān)A4在2006-2008年單花花粉量均為0，不育性年際間表現(xiàn)較為穩(wěn)定；PA5在不同年份單花均產(chǎn)生微量花粉，單花花粉量在年際間略有變化(表6)。

2.2.4溫度對(duì)桔梗不育穩(wěn)定性的影響 在自然溫度條件下，桔梗單株P(guān)A2花藥干枯癟小，花藥中無花粉量產(chǎn)生，而在低溫條件下，花藥外形略有增大，產(chǎn)生少量敗育花粉；微粉單株P(guān)A13在低溫條件下花粉量有所增加，而且產(chǎn)生少量的可育花粉(表7)。表明在低溫條件下桔梗微量花粉單株其花粉量有明顯增加，而溫度對(duì)桔梗徹底敗育單株育性影響較小。

表6 桔梗育性年際間的表現(xiàn)

表7 溫度對(duì)育性表現(xiàn)的影響

2.2.5光照對(duì)桔梗不育穩(wěn)定性的影響 9、15 h光照處理下PA14產(chǎn)生極少敗育花粉，12 h和中斷暗期處理?xiàng)l件下PA14未見花粉形成(表8)，表明光照長度對(duì)桔梗不育性表現(xiàn)無明顯影響。

表8 光照長度對(duì)育性表現(xiàn)的影響

2.3桔梗雄性不育性遺傳特性研究 PA2、PA4為商洛栽培居群中篩選鑒定出的敗育單株，F(xiàn)A1～16為商州栽培居群中篩選的可育單株，PF2、PF3、PF5分別為唐塬、丹鳳、洛南栽培種篩選出的可育單株；ZB1和ZB2為淄博栽培種中篩選的可育單株，2007年以不育株為母本、可育株為父本配置組合。不育株P(guān)A2、PA4與來源相同的可育株之間的組合后代，除了PA2×PF3組合后代出現(xiàn)5%左右的可育株外，其余組合后代均不育；而PA4與源于淄博的兩個(gè)可育單株的組配后代均表現(xiàn)可育(表9)。表明在商洛栽培種中存在不育材料PA2、PA4的保持基因，而在淄博栽培種中存在不育材料的恢復(fù)基因。

表9 不育性株后代的育性表現(xiàn)

3 討論與結(jié)論

自然條件下，高等植物群體中出現(xiàn)雄性不育突變體是一種較為普遍的現(xiàn)象。桔梗不育種質(zhì)在吉林[10]、山東[11]等地已有發(fā)現(xiàn)。本研究在2006年桔梗花期期間，在當(dāng)?shù)亟酃Ｈ后w中發(fā)現(xiàn)桔梗雄性不育單株12個(gè)，并用22份來源不同的桔?？捎牧辖o其授粉，5個(gè)測(cè)交后代不育株率在95%以上，表明桔梗不育突變材料可以穩(wěn)定保存。對(duì)不育突變單株花粉、柱頭、胚珠活性以及結(jié)實(shí)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示不育花無花粉或有微量敗育花粉，而柱頭、胚珠發(fā)育正常，田間授粉結(jié)籽率與相同來源的正?；o明顯差異，這與吳基日等[10]、王志芬等[11]的研究結(jié)果一致。新桔梗雄性不育突變體的發(fā)現(xiàn)拓寬了不育種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)，并為桔梗雜種優(yōu)勢(shì)利用提供了物質(zhì)材料。

植物性狀表現(xiàn)受基因的控制，同時(shí)也或多或少地受到其生長環(huán)境的影響，性狀表現(xiàn)是基因活動(dòng)及其環(huán)境作用的總結(jié)果。魏建和[9]在不同桔梗種群中篩選出了雄性不育突變材料共15個(gè)單株，對(duì)其測(cè)交后代的遺傳分析結(jié)果表明，這些不育材料分屬兩種不育類型，即核不育型和胞質(zhì)不育型。這與本研究發(fā)現(xiàn)的桔梗不育材料的敗育類型有所不同，對(duì)不育株組配的交配后代分析表明，雄性不育材料很可能為核質(zhì)互作不育型，這為通過雄性不育性利用桔梗雜種優(yōu)勢(shì)提供了更為豐富的遺傳材料。另外，對(duì)桔梗不育材料育性穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，表明桔梗徹底敗育單株在不同光照、不同溫度、不同營養(yǎng)條件以及不同地域栽培等環(huán)境因子對(duì)其育性影響較小，而“微粉單株”花粉量變化在一定范圍內(nèi)受到環(huán)境的修飾。這一結(jié)果對(duì)新發(fā)現(xiàn)和鑒定的桔梗不育材料的評(píng)價(jià)提供依據(jù)，可為桔梗不育材料的利用途徑及桔梗不育系選育策略的確定、親本繁育及桔梗雜交種制種策略的制定、桔梗雜種優(yōu)勢(shì)利用潛在的經(jīng)濟(jì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

植物雜種優(yōu)勢(shì)利用的途徑主要是根據(jù)植物開花習(xí)性、花器特征、授粉繁殖方式以及特殊突變體材料特點(diǎn)等因素制定[13]。桔梗屬常異花授粉植物，主要采用種子繁殖，但其藥用部位為生長2年的根條，根據(jù)這一特點(diǎn)，通過質(zhì)核互作不育性利用桔梗雜種優(yōu)勢(shì)的途徑可設(shè)計(jì)為：不育系、保持系和強(qiáng)優(yōu)系。通過不育系×強(qiáng)優(yōu)系制備雜交種，這一模式和傳統(tǒng)作物“三系”制種的不同在于傳統(tǒng)作物獲取種子為生產(chǎn)目的；通過不育系×恢復(fù)系生產(chǎn)的雜交種必須可育，而通過強(qiáng)優(yōu)系制備的F1桔梗雜交種只要求根部產(chǎn)量，對(duì)于F1的育性沒有要求。如果應(yīng)用于生產(chǎn)的F1雜交種是不育的，那么制種父本則不適合再稱為“恢復(fù)系”，同時(shí)為了與自交系相區(qū)別，將這種制種父本稱為“強(qiáng)優(yōu)系”。

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