孫 濤，劉左軍，孫文斌，劉鳳梅，李 冰

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

ISSR(Inter-simple sequence repeat)又稱簡單重復(fù)序列擴(kuò)增，是由Zietkiewicz等[1]1994年提出的一種DNA標(biāo)記技術(shù)，是近年來發(fā)展起來的一類新型的分子標(biāo)記技術(shù)。ISSR標(biāo)記技術(shù)具有無需知道任何靶標(biāo)序列的微衛(wèi)星背景信息、遺傳多態(tài)性高、檢測快等特點(diǎn)，在植物分類與進(jìn)化、遺傳多樣性研究以及遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位方面具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。雖然ISSR-PCR具有重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)[3]，但不同材料、不同引物的擴(kuò)增條件有異，反應(yīng)體系不同也可產(chǎn)生不同的結(jié)果。因此，有必要建立與優(yōu)化不同實(shí)驗(yàn)材料的ISSR-PCR的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，以期獲得穩(wěn)定、可靠的ISSR 分析結(jié)果。

鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)為毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亞科銀蓮花屬(Anemone)[4]植物。分布于喜馬拉雅山區(qū)和青藏高原東緣，祁連山、帕米爾高原一帶，多數(shù)分布于西南部。由于其生長海拔高、生境分布廣泛、進(jìn)化較為低等，是很好的分子遺傳學(xué)和分子生態(tài)學(xué)的研究材料[5]。因此，本研究通過提取甘肅合作的高寒草甸地區(qū)鈍裂銀蓮花的DNA，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對銀蓮花進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，以期建立重復(fù)性高、反應(yīng)條件穩(wěn)定的反應(yīng)體系，為深入研究高寒草甸銀蓮花屬植物遺傳多樣性[6]奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 鈍裂銀蓮花樣品采集于甘肅省甘南藏族自治州合作市(海拔2 973 m，34°57′ N，102°53′ E)，材料采后立即放入保鮮袋中，用硅膠干燥保存。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品與儀器 引物UBC807(AG)8T、Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、100 bp DNA Ladder Plus Marker(購自上海生物工程有限公司)，PCR儀(型號MG96+，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))、電泳儀(型號DYY-11，北京六一儀器公司生產(chǎn))。

1.3DNA的提取及檢測 采集鈍裂銀蓮花幼苗期嫩葉，采用改良的CTAB法[7]提取獲得基因組DNA，即用氯仿-異戊醇抽提之前加用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，以減少酚類物質(zhì)和其他雜質(zhì)的含量。用紫外可見分光光度計測定260、280 nm處的吸收值，計算DNA的含量。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質(zhì)量。

1.4ISSR-PCR反應(yīng)體系設(shè)計與PCR擴(kuò)增

1.4.1ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計 采用L16(54)正交試驗(yàn)設(shè)計對模板濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度進(jìn)行5因素4水平篩選(表1、表2)。

按表2設(shè)計的16個反應(yīng)體系組合，每個處理重復(fù)2次進(jìn)行加樣，PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL。PCR擴(kuò)增程序[8]：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，引物退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓為100 V) 分析擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察成像記錄。

表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系的因素與水平

表2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計

1.4.2ISSR-PCR反應(yīng)體系的單因素試驗(yàn)設(shè)計 在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對反應(yīng)體系中各因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。將正交體系中得到的特異性譜帶清晰、譜帶多態(tài)性較高，且譜帶穩(wěn)定的體系中的5個因素最優(yōu)水平的設(shè)為固定值，對單個因素進(jìn)行梯度篩選，將篩選出的該因素的最佳值作為固定值，然后將其他4個因素中的一個作為變量進(jìn)行梯度篩選，其他3個固定因素不變，這樣，依次完成對各因素的篩選，從而得到最佳反應(yīng)體系[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1DNA的提取與檢測 提取高質(zhì)量的鈍裂銀蓮花基因組的DNA是ISSR擴(kuò)增成功與否的關(guān)鍵。本試驗(yàn)用改進(jìn)的CTAB法，所提取的DNA的電泳顯示在點(diǎn)樣孔附近都呈現(xiàn)出一條亮帶；且條帶整齊明亮，沒有明顯的拖尾，也未見RNA條帶，說明提取的DNA質(zhì)量高，完整性好，可用于ISSR體系優(yōu)化分析和其他試驗(yàn)(圖1)。

2.2ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化 參照何正文等的方法[11]，根據(jù)本試驗(yàn)的正交設(shè)計PCR擴(kuò)增結(jié)果和電泳檢測，依據(jù)瓊脂糖電泳譜帶的強(qiáng)弱和雜帶的多少進(jìn)行直觀分析。不同處理間，由于dNTP、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶的濃度不同，其擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異(圖2)。反應(yīng)體系1、9、14沒有條帶出現(xiàn)；2、5、13拖帶，背景較重；4擴(kuò)增條帶較弱，但多態(tài)性較高;6擴(kuò)增條帶的多態(tài)性較低，且譜帶較弱；8、16只有兩條清晰的條帶，擴(kuò)增條帶的多態(tài)性較低；16為模板、dNTP濃度和Mg2+濃度過高，使Taq DNA聚合酶的活性降低，反應(yīng)不完全；10、11、12、15擴(kuò)增條帶的多態(tài)性較低，且譜帶較弱；3、7擴(kuò)增條帶多態(tài)性高，且較清晰，但7中 Taq DNA聚合酶濃度過低，可能會使反應(yīng)無法充分進(jìn)行，從而影響擴(kuò)增效果[12]。最佳組合應(yīng)選擇特異性譜帶清晰、譜帶多態(tài)性較高，且譜帶穩(wěn)定的組合[13]，故本試驗(yàn)選擇反應(yīng)體系3為最佳組合，即20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中含有模板20 ng、10×PCR Buffer 2 μL、dNTPs 0.3 mmol·L-1、引物0.4 mmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1、和3 U Taq DNA聚合酶。

圖1 鈍裂銀蓮花24個樣品基因組DNA電泳檢測

圖2 正交試驗(yàn)設(shè)計ISSR-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果

2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系的單因素試驗(yàn)

2.3.1不同模板DNA濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響 DNA模板的質(zhì)量和用量是ISSR-PCR擴(kuò)增效果的重要影響因素[14]，用量過高會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，甚至抑制擴(kuò)增的進(jìn)行，濃度過低則得不到擴(kuò)增產(chǎn)物。本試驗(yàn)設(shè)置了4個模板DNA的梯度(圖3)，模板DNA為20 ng時，擴(kuò)增條帶多且較亮；為40 ng時，擴(kuò)增條帶清晰且背景弱；為60、80 ng時，擴(kuò)增條帶較強(qiáng)，背景較亮，多態(tài)性較差。因此，本試驗(yàn)選擇40 ng為反應(yīng)體系中模板DNA的用量。

2.3.2dNTP濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響 dNTP作為ISSR-PCR反應(yīng)的原料參與新鏈DNA的合成過程。在PCR反應(yīng)中，dNTPs的用量影響到堿基摻入的正確與否以及擴(kuò)增產(chǎn)率的高低，濃度過高或過低都導(dǎo)致分子量相對較大的條帶得不到有效擴(kuò)增。本試驗(yàn)設(shè)置了0.1、0.2、0.3和0.4 mmol·L-1共4個濃度梯度。dNTPs濃度為0.1 mmol·L-1時擴(kuò)增條帶模糊，為0.2 mmol·L-1時，擴(kuò)增條帶清晰，但背景較高，0.3 mmol·L-1時擴(kuò)增條帶清晰，背景清晰，產(chǎn)率最高，0.4 mmol·L-1時出現(xiàn)非特異性條帶(圖4)。因此，鈍裂銀蓮花ISSR-PCR反應(yīng)體系選擇0.3 mmol·L-1的dNTPs濃度。

圖3 不同的模板DNA用量下的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 不同的dNTP濃度用量下的擴(kuò)增結(jié)果

2.3.3Mg2+濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響 Mg2+作為TaqDNA聚合酶的輔因子，它影響著TagDNA聚合酶的活性、退火溫度和產(chǎn)物的特異性，而且能和反應(yīng)體系中的dNTP、模板DNA和引物結(jié)合，影響它們的有效濃度[15]，從而影響ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果。本試驗(yàn)驗(yàn)設(shè)置了1.0、1.5、2.0和2.5 mmol·L-1共4個梯度。當(dāng)Mg2+濃度為1.0 mmol·L-1時擴(kuò)增條帶不穩(wěn)定且背景較重，1.5 mmol·L-1時擴(kuò)增條帶不穩(wěn)定，2.0 mmol·L-1時擴(kuò)增條帶減少，2.5 mmol·L-1時能擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定的條帶且無非特異性擴(kuò)增(圖5)。因此，在鈍裂銀蓮花遺傳多樣性ISSR分析中，Mg2+濃度以2.5 mmol·L-1較為適宜。

圖5 不同的Mg2+濃度用量下的擴(kuò)增結(jié)果

2.3.4TagDNA聚合酶濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響 在PCR反應(yīng)中，Taq DNA聚合酶的用量是擴(kuò)增結(jié)果的一個重要因素。用量過多不僅增加試驗(yàn)成本，而且容易擴(kuò)增出非特異性條帶。本試驗(yàn)設(shè)置了1、2、3、4 U共4個梯度。當(dāng)酶的用量為1 U時條帶很弱，說明酶用量不足，2 U時條帶清晰且非特異性條帶少，產(chǎn)物穩(wěn)定，3和4 U時條帶強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但有非特異性條帶出現(xiàn)(圖6)。因此，在鈍裂銀蓮花遺傳多樣性ISSR分析中，Taq DNA聚合酶以2 U較為適宜。

2.3.5引物濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響 PCR中過高的引物濃度會造成引物二聚體。因此，本試驗(yàn)設(shè)置0.2、0.3、0.4和0.5 mmol·L-14個濃度梯度。濃度在0.2和0.3 mmol·L-1時，擴(kuò)增條帶弱，背景較亮，而在0.4和0.5 mmol·L-1時，可以擴(kuò)增出較為清晰穩(wěn)定的條帶(圖7)。因此，在鈍裂銀蓮花遺傳多樣性ISSR分析中，最佳引物濃度為0.4 mmol·L-1。

圖6 不同TagDNA聚合酶濃度用量下的擴(kuò)增結(jié)果

圖7 不同的引物濃度用量下的擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)利用正交設(shè)計的方法得到了鈍裂銀蓮花ISSR-PCR反應(yīng)的最佳試驗(yàn)條件的組合，即：20 ng、10×PCR Buffer 2 μL、dNTPs 0.3 mmol·L-1、引物0.4 mmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1和3 U Taq DNA聚合酶。但該方法也存在著一定的局限性，不能很好地估計試驗(yàn)誤差。在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合單因子試驗(yàn)的方法，這兩種方法的結(jié)合，不僅克服了正交試驗(yàn)主觀上造成的誤差，也克服了單因素忽視了各因子間的相互效應(yīng)的影響，所得到的模板、dNTPs和引物最佳濃度是一致的，證明了試驗(yàn)的可信度[16-17]；另外在Taq DNA聚合酶和Mg2+最佳濃度的確定上，兩種方法的結(jié)果存在差異，這可能與PCR反應(yīng)的不穩(wěn)定性有關(guān)系，也可能是由于兩者各自的局限性所造成的。結(jié)合兩種方法，盡可能減少試驗(yàn)誤差。該試驗(yàn)中模板量較低，擴(kuò)增條帶弱且少，模板量較大，擴(kuò)增條帶較強(qiáng)；dNTPs濃度對結(jié)果影響較小，較低濃度擴(kuò)增條帶模糊，較高出現(xiàn)非特異性條帶；Mg2+濃度過低造成擴(kuò)增產(chǎn)物量不足，過高出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。說明鈍裂銀蓮花ISSR反應(yīng)體系對Mg2+濃度較為敏感；Taq DNA聚合酶濃度過低條帶弱，過高出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物且成本過高；引物濃度對結(jié)果影響不太明顯，都有條帶出現(xiàn)，說明體系對引物的濃度不敏感[18-19]。

致謝：本研究得到了蘭州大學(xué)高寒草甸與濕地生態(tài)系統(tǒng)定位研究站的支持與幫助，在此衷心感謝！

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