李翠霞，李志忠，張 繼

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050； 2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

百里香(Thymusvulgaris)是唇形科百里香屬多年生芳香植物[1]，百里香屬植物所含的化學(xué)成分主要為揮發(fā)性脂肪酸衍生物等[2-3]。在百里香中脂肪酸衍生物合成的主要調(diào)控酶是脂氧合酶(LOX)，它能夠催化亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性物質(zhì)[4]。揮發(fā)性物質(zhì)的釋放與百里香植株抵抗和防御非生物機(jī)械損傷和環(huán)境脅迫而做出的反應(yīng)有關(guān)[5]。已有研究報(bào)道表明，植物中LOX通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，只有當(dāng)生物體發(fā)育到一定階段或受到環(huán)境脅迫時(shí)才啟動(dòng)[6-7]。因此，研究不同外源處理因素對(duì)LOX活性的影響，可以為研究植物在抵抗不同的自然環(huán)境、防御非生物機(jī)械損傷以及環(huán)境脅迫的反應(yīng)提供理論依據(jù)。本研究以百里香為材料，分析在培養(yǎng)基中添加不同的碳氮源配比、前體誘導(dǎo)因素以及噴施不同外源誘導(dǎo)物對(duì)增殖百里香中LOX活性的影響，以期揭示LOX的誘導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 百里香種子采自甘肅康樂地區(qū)。試驗(yàn)材料處理方法及儀器試劑參見文獻(xiàn)[8]。

1.2試驗(yàn)處理

1.2.1碳氮源調(diào)控 培養(yǎng)基中碳源和氮源的調(diào)控方法參見文獻(xiàn)[8]。

1.2.2前體調(diào)控 在1/2 MS培養(yǎng)基上分別添加濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1的苯丙氨酸、谷氨酸和丙酮酸3種前體誘導(dǎo)物，每個(gè)處理均設(shè)8個(gè)重復(fù)，觀察再生植株的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)30 d后測(cè)定不同誘導(dǎo)處理下再生植株中脂氧合酶活性。

1.2.3外源處理因素的調(diào)控 外源誘導(dǎo)處理方法參見文獻(xiàn)[8]。分別在處理后0、12、24、48、72、96和120 h取樣，測(cè)定LOX活性，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3脂氧合酶活性測(cè)定 取0.3 g百里香，參考文獻(xiàn)[9]中方法并略作修改，加入3 mL磷酸提取緩沖液[pH值6.5，1%TritonX-100R(V/V)和1%PVP]于冰浴中研磨成漿。4 ℃、9 000 r·min-1下離心15 min，測(cè)定上清液LOX活性。反應(yīng)液組成：0.1 mL Tween-20分散于10 mL硼酸緩沖液中(0.2 mol·L-1,pH值9.0)，加入0.1 g亞油酸充分混勻，再加入1.0 mol·L-1的NaOH 0.3 mL充分震蕩，pH值調(diào)至6.2，稀釋20倍。測(cè)定酶活性時(shí)，將0.1 mL酶液和0.5 mL的底物混合置于25 ℃的水浴中保溫4 min，加入2.4 mL的無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，234 nm處測(cè)定OD值。LOX活性以每克植株鮮質(zhì)量每分鐘1個(gè)OD234 nm值的變化為酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1碳氮源調(diào)控對(duì)LOX活性的影響 在蔗糖濃度為1%～4%時(shí)，隨著蔗糖濃度的升高LOX的活性逐漸升高，蔗糖為4%時(shí)LOX活性為32.7 U·g-1，極顯著高于對(duì)照(3%)(P<0.01)，當(dāng)蔗糖濃度為1%和5%時(shí)，其活性分別僅為18.1和22.4 U·g-1，這說明蔗糖濃度對(duì)LOX影響較大，但是高濃度的碳源會(huì)抑制植株的生長(zhǎng)，并且使葉片較小(圖1)。當(dāng)NO3--N/NH4+-N比例為0∶1時(shí)LOX活性達(dá)到最大，為33.19 U·g-1，但由于缺乏氨態(tài)氮，植株出現(xiàn)葉片發(fā)黃，莖段較細(xì)，生長(zhǎng)慢等現(xiàn)象，比例為2∶1(對(duì)照)時(shí)LOX活性較高，酶活達(dá)30.99 U·g-1，并且此時(shí)植株生長(zhǎng)最旺盛。

2.2前體調(diào)控 添加前體物質(zhì)會(huì)影響LOX的活性，添加0.6 mmol·L-1苯丙氨酸誘導(dǎo)百里香植株時(shí),LOX活性達(dá)到峰值，為對(duì)照組的138.9%，而添加0.4 mmol·L-1谷氨酸誘導(dǎo)百里香植株時(shí)，LOX活性達(dá)到峰值，為對(duì)照組的116.4%。高濃度的谷氨酸會(huì)抑制LOX活性，添加1.0 mmol·L-1谷氨酸時(shí)，LOX活性為對(duì)照的86.8%，添加丙酮酸對(duì)LOX活性基本沒有影響(圖2)。

2.3外源處理因素調(diào)控

2.3.1茉莉酸甲酯誘導(dǎo) 不同濃度的茉莉酸甲酯處理后，3個(gè)發(fā)育階段百里香植株LOX活性的變化存在顯著差異(P<0.05)(圖3)。20 d的植株經(jīng)1.0 mmol·L-1MeJA誘導(dǎo)后，LOX的活性顯著增加，48 h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的655.4%。30 d和40 d的植株經(jīng)0.5 mmol·L-1MeJA誘導(dǎo)后48 h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的688.1%和456.1%，48 h后緩慢下降?？梢?，茉莉酸甲酯對(duì)不同年齡百里香再生植株中LOX活性的誘導(dǎo)存在最佳濃度和最佳時(shí)間。

2.3.2水楊酸誘導(dǎo) 不同濃度的水楊酸(SA)處理后，3個(gè)發(fā)育階段百里香植株LOX活性的變化有顯著差異(圖4)。經(jīng)150 mg·L-1SA誘導(dǎo)12 h時(shí)LOX活性顯著增加，達(dá)到峰值，20 d的植株誘導(dǎo)后為對(duì)照組的503.8%。30 d的植株誘導(dǎo)后為對(duì)照組的383.8%，48 h后下降。40 d的植株經(jīng)SA誘導(dǎo)后，LOX活性增加緩慢，誘導(dǎo)效果不明顯。水楊酸對(duì)百里香中LOX活性的影響存在最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。

圖2 不同濃度的前體誘導(dǎo)物對(duì)對(duì)百里香再生植株內(nèi)LOX影響Fig.2 Effects of different precursors on LOX activity in leaves of Thymus vulgaris

2.3.3殼聚糖誘導(dǎo) 采用不同濃度的殼聚糖(Chitosan)處理后，3個(gè)發(fā)育階段百里香植株LOX活性的變化存在顯著差異(圖5)。經(jīng)200 mg·L-1殼聚糖誘導(dǎo)后，LOX的活性顯著增加，24 h時(shí)達(dá)到峰值，20和30 d的植株LOX的活性分別為對(duì)照組的429.1%和360.8%，72 h后急速下降，120 h酶活性減少。40 d的植株經(jīng)200 mg·L-1殼聚糖誘導(dǎo)后，LOX活性增加緩慢，并在處理72 h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的379.5%。殼聚糖對(duì)百里香中LOX活性的影響存在最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。

3 討論

植物在外源處理因素的作用下會(huì)做出一系列的抗逆反應(yīng)，引起植物體內(nèi)抗逆信號(hào)分子以及誘導(dǎo)抗性蛋白的合成，進(jìn)而引起一系列抗脅迫反應(yīng)[10]。本研究分析了不同處理因素對(duì)不同生長(zhǎng)階段百里香植株中揮發(fā)性物質(zhì)合成途徑中關(guān)鍵酶LOX活性的影響。

圖3 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)對(duì)20、30和40 d百里香再生植株內(nèi)脂氧合酶活性的影響Fig.3 Effects of MeJA on LOX activity in leaves of Thymus vulgaris cultured for 20, 30 and 40 d

圖4 水楊酸誘導(dǎo)對(duì)20、30和40 d百里香再生植株內(nèi)脂氧合酶活性的影響Fig.4 Effects of SA on LOX activity in leaves of Thymus vulgaris cultured for 20, 30 and 40 d

圖5 殼聚糖誘導(dǎo)對(duì)20、30和 40 d百里香再生植株內(nèi)脂氧合酶活性的影響Fig.5 Effects of chitosan on LOX activity in leaves of Thymus vulgaris cultured for 20, 30 and 40 d

糖是植物生長(zhǎng)過程中不可缺少的碳源，其種類和濃度對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)起著重要作用[11]。本試驗(yàn)是在1/2 MS培養(yǎng)基上，以3%為對(duì)照組，改變不同的碳源的濃度，培養(yǎng)30 d后，測(cè)定LOX活性，當(dāng)蔗糖濃度為4%時(shí)，能量充足，酶活性達(dá)到最高，但由于過高的滲透壓對(duì)植物的生長(zhǎng)有抑制作用， 蔗糖濃度為3%時(shí)，酶活較高，生長(zhǎng)狀態(tài)最好，達(dá)到適宜配比，此結(jié)果與已有研究結(jié)論相一致。氮源是細(xì)胞中核酸的組成成分，植物在生長(zhǎng)過程中不可或缺，其種類和濃度對(duì)植物生長(zhǎng)影響也非常顯著[12]。氮源調(diào)控結(jié)果表明，在百里香生長(zhǎng)和LOX活性調(diào)控中氮源起到一定的作用，缺乏硝態(tài)氮和氨態(tài)氮都會(huì)影響植物生長(zhǎng)以及LOX活性，在調(diào)控中硝態(tài)氮起主要作用，比例為0∶1的NO3--N/NH4+-N時(shí)LOX活性達(dá)到最大，但缺乏硝態(tài)氮時(shí)植株發(fā)育不良且生長(zhǎng)緩慢。有研究證明其可能原因是培養(yǎng)基中NH4+量太高導(dǎo)致培養(yǎng)基酸化[13]，細(xì)胞毒性增加，抑制植物生長(zhǎng)。當(dāng)NO3--N/NH4+-N比例為2∶1時(shí),獲得百里香最佳生長(zhǎng)狀態(tài)和LOX活性最高的最佳配比，說明前誘導(dǎo)物碳源和氮源的改變能夠調(diào)節(jié)百里香揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生過程中關(guān)鍵酶LOX的活性，碳源和氮源可改變百里香中揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生。

有研究報(bào)道,在培養(yǎng)基中添加氨基酸能夠被植物吸收，與無(wú)機(jī)氮共存時(shí)也能被植物所利用，且不同種類的氨基酸表現(xiàn)出不同的生理效應(yīng)，被吸收后能在植物體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)、分配，其代謝的機(jī)制有一定的差異[14]。在培養(yǎng)基中添加已知或假定的前體氨基酸，能消除關(guān)鍵酶阻礙或阻斷內(nèi)源性中間體的分隔[15]。在三尖杉(Cephalotaxusfortunei)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中，添加前體物質(zhì)酪氨酸和苯丙氨酸也不同程度地提高了三尖杉酯堿的含量[16]。本研究通過在特定培養(yǎng)基上加入苯丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸后發(fā)現(xiàn)，前兩種前體物質(zhì)均在一定程度上提高了百里香植株中的LOX活性，而丙酮酸對(duì)LOX活性影響效果不明顯。李彩鳳等[17]研究證明LOX活性部位基團(tuán)和芳香族氨基酸殘基等有關(guān)。此結(jié)果與已有其他科植物的部分研究結(jié)果一致，但對(duì)百里香中的研究尚無(wú)報(bào)道。

外源誘導(dǎo)物能夠改變植物次生代謝途徑中酶活性或活化次生代謝途徑中特定的酶，然后誘導(dǎo)新酶的形成，引起次生代謝途徑的代謝途徑和生化反應(yīng)速率的改變[18]。植物體內(nèi)存在一類外源大分子物質(zhì)，其可以激發(fā)植物的抗病防御反應(yīng)，這類大分子物質(zhì)能誘導(dǎo)與植物防御反應(yīng)相關(guān)的結(jié)構(gòu)或生物化學(xué)反應(yīng)[19]。本研究對(duì)不同生長(zhǎng)階段的百里香使用外源茉莉酸甲酯、水楊酸和殼聚糖進(jìn)行處理。茉莉酸及其甲酯廣泛存在于高等植物體內(nèi)，它是由亞麻酸經(jīng)脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶等一系列酶促反應(yīng)而生成[20]。SA是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一種酚類化合物，也是植物組織中一種天然活性物質(zhì)，它作為一種信號(hào)分子對(duì)一些重要的代謝過程起調(diào)控作用[21]。前人研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖也可以提高作物對(duì)病原菌的抗性[22]。這3種外源誘導(dǎo)因素均能改變百里香中揮發(fā)性物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶LOX活性，并且外源處理因素存在最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明不同處理因素在不同濃度和時(shí)間條件下LOX的活性不同，該結(jié)論為外源處理因素誘導(dǎo)百里香揮發(fā)性物質(zhì)的合成和積累提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為研究百里香抗逆反應(yīng)的機(jī)理提供了一定的依據(jù)。

Rangel等[23]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)物質(zhì)如茉莉酸甲酯等對(duì)LOX活性有一定的影響。本研究通過對(duì)不同生長(zhǎng)階段百里香植株進(jìn)行誘導(dǎo)處理后也得到類似結(jié)論，此結(jié)論為揭示該類植物的抗逆生理機(jī)制以及誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物合成過程中關(guān)鍵酶活性的提高提供了一定的理論依據(jù)，進(jìn)而為誘導(dǎo)處理因子對(duì)植物調(diào)控機(jī)理方面的研究奠定了一定基礎(chǔ)。

[1] 張繼,田玉汝,劉忠旺.百里香屬植物研究進(jìn)展[J].北方園藝,2010(1):226-228.

[2] 賈紅麗,計(jì)巧靈,張丕鴻.新疆?dāng)M百里香揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜分析[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2008,29(1):36-41.

[3] Penuelas J，Llusia J.PVOCs:Plant defense against climatic warming[J].Trends in Plant Science,2003(8):105-109．

[4] Blee E.Impact of phyto oxylipins in plant defense[J].Trends in Plant Science，2002(7):315-321．

[5] Minke A N，Gerrit A V.Johannes F G V.Fatty acid hydroperoxide lyase: A plant cyto-chro-me P450 enzyme involved in wound healing and pest resistance[J].Chembiochem,2001,32(7):494-504.

[6] Gardner W H.Biological roles and biochem is try of the lipoxygenase pathway[J].Hortscience，1995，30(2):197-205.

[7] 陳惠萍，徐朗萊.殼聚糖調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育及誘發(fā)植物抗病性研究進(jìn)展[J].云南植物研究,2005,27(6):613-619．

[8] 楊寧，李翠霞，李志忠，等.誘導(dǎo)子對(duì)百里香再生植株中苯丙氨酸解氨酶活性的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2012,32(2):0330-0335.

[9] Axelrod B，Cheesbrough T M，Leakso S.Lipoxygenase from soybeans[J].Methods in Enzymology,1981(7)：443-451．

[10] 梅伏生，孟祥高，趙顯珍，等.脂氧合酶——植物抗脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵酶[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005，39(3):346-350.

[11] 董誠(chéng)明,蘇秀紅,王偉麗.氮碳源對(duì)冬凌草再生植株生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響[J].西北植物學(xué)報(bào),2009,29(3):494-498.

[12] 高增平,江佩,芬何斌.野生石蒜與其組織培養(yǎng)品的化學(xué)成分對(duì)比研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),1995,18(3):60-64.

[13] 郭肖紅,高文遠(yuǎn),李克峰.丹參不定根組織培養(yǎng)的研究(Ⅱ)碳源、氮源和磷源對(duì)丹參不定根培養(yǎng)的影響[J].中草藥,2007,35(6):907-911．

[14] 馬林.植物對(duì)氨基酸的吸收和利用[J].西南科技大學(xué)學(xué)報(bào),2004,19(1):102-107.

[15] 方唯碩.植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用與局限性[J].國(guó)外醫(yī)藥——植物藥分冊(cè),1995,10(5):213-217.

[16] Dlxon R A.Natural products and plant disease resistance[J].Nature,2001(41):843-847.

[17] 李彩鳳，趙麗影，陳業(yè)婷，等.高等植物脂氧合酶研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(10)：143-149.

[18] Bi J L，Murphy J B，F(xiàn)elton G W.Antinutritive and oxidative components as mechanisms of induce in cotton to helicoverpa zea[J].Journal of Chemical Ecology,1997,23(1):97-117．

[19] 趙紅蓮，于榮敏.誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000,17(2):152-156.

[20] 蔡昆爭(zhēng),董桃杏,徐濤.茉莉酸類物質(zhì)(JAs)的生理特性及其在逆境脅迫中的抗性作用[J].生態(tài)環(huán)境,2006，15(2):397-404.

[21] 鄭偉尉,臧運(yùn)祥.水楊酸(SA)與植物抗病性關(guān)系的研究進(jìn)展[J].河北果樹,2005(1):1-2.

[22] 宋滿坡，段曉琴.殼聚糖對(duì)黃瓜常見病原菌的抑制效應(yīng)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(1):61-67.

[23] Rangel M,Machado O L,da Cunha M,etal.Accumulation of chloroplast-targeted lipoxygenase in passon fruit leaves in response to methyl jasmonate [J].Phytochemistry,2002,60:6219-6251.