胡 靜，謝俊仁，王鎖民

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730046)

18S rRNA基因(rDNA)廣泛存在于真核細(xì)胞中，是除病毒以外所有生物都具有的基因，在進(jìn)化過程中表現(xiàn)出高度的保守性[1]。現(xiàn)已在許多高等植物中克隆了18S rRNA，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)(GQ380689.1)、白銀楊(Populusalba)(DQ371807.1)、小盤木(Galeariafiliformis)(AB233598.1)、驅(qū)蟲莧(Cnidoscolusaconitifolius)(AB268093.1)及橡膠樹(Heveabrasiliensis)(AB268099.1)等。18S rRNA在生物體內(nèi)執(zhí)行著重要的生物學(xué)功能[2]，它能與相關(guān)蛋白組成核糖體小亞基，然后通過核孔再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中參與核糖體循環(huán)。目前18S rRNA基因主要在中草藥鑒定中被應(yīng)用[3]。此外，18S rRNA是唯一具有信息分子和功能分子兩種作用的編碼核糖體基因，以連續(xù)排列方式存在于細(xì)胞內(nèi)，結(jié)構(gòu)和堿基排列復(fù)雜度適中，較易于進(jìn)行序列測定和分析比較。因此，18S rRNA是研究物種進(jìn)化關(guān)系比較簡便的手段之一[4]。

Kranz和Huss[5]利用18S rDNA序列對蕨類植物的分子進(jìn)化及蕨類植物與種子植物間的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，石松類植物是單系分支，且是陸生維管植物的最早分支;相對于別的蕨類植物，松葉蕨屬(Psilotum)與種子植物具有更近的親緣關(guān)系。Chaw等[6]探討了裸子植物的分子系統(tǒng)發(fā)育及種子植物的進(jìn)化，Soltis等[7]利用18S rRNA序列系統(tǒng)闡明了被子植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，而梁江等[8]通過18S rRNA基因序列分析不同豆科作物的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大豆相對于其他豆科作物在系統(tǒng)發(fā)育上處于比較原始的位置?？梢?，18S rRNA基因序列已逐漸成為研究生物進(jìn)化的依據(jù)之一[9-10]。

霸王(Zygophyllumxanthoxylum)又稱霸王柴，蒺藜科，是一種強(qiáng)旱生小灌木，為古老的荒漠殘遺植物，起源于古非洲[11]，現(xiàn)主要分布在亞洲中部荒漠區(qū)[12]，是我國西北荒漠草原上的主要植被之一[13]。霸王作為古老殘遺的抗旱植物有著十分重要的研究價(jià)值[14]，已受到廣泛重視，在形態(tài)解剖學(xué)[15]、逆境生理[16]、分子生物學(xué)[17-18]、組織培養(yǎng)[19-20]和遺傳多樣性[12]等方面都開展了相關(guān)研究。然而，尚未見到有關(guān)霸王18S rRNA基因及分子進(jìn)化方面的報(bào)道。為此，本研究克隆了霸王的18S rRNA基因，分析其序列結(jié)構(gòu)，以期為霸王的生物進(jìn)化研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 霸王種子于2010年10月采自甘肅省治沙研究所民勤治沙綜合試驗(yàn)站。PCR擴(kuò)增試劑盒Adcantage?2 PCR kit購自Clonetech公司；凝膠回收試劑盒UNIQ-10及植物DNA提取試劑盒Ezup均購自上海生工生物有限公司；克隆載體pGEM-T Easy vector Kit 購自Promega 公司；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1霸王基因組DNA的提取 以3周齡霸王幼苗葉為材料，參照Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒的操作說明提取霸王基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.2.2PCR 擴(kuò)增 參照Sogin[21]設(shè)計(jì)的18S rRNA通用引物，上游引物P1：CAACCTGGTTGATCCTGCCAGT，下游引物P2：CTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC。引物由上海生工合成。

PCR 反應(yīng)體系：10× Buffer 5 μL，50× dNTP mix 1 μL，polymerase mix 1 μL，DNA 1 μL，P1、P2(10 pmol·L-1)各1 μL，加水至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 °C 預(yù)變性5 min；94 °C 變性30 s、57 °C 退火30 s、72 °C 延伸2 min，31個(gè)循環(huán)；72 °C延伸5 min；4 °C 保存。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測，目的片段的回收和純化按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.2.3PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆 將回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化JM109后經(jīng)含100 μg·mL- 1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后，送至上海生工生物有限公司測序。

1.2.4核酸序列的分析 Blast搜索在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)網(wǎng)站上進(jìn)行，序列的比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析在DNAMAN生物軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1霸王總DNA的提取 提取的霸王基因組DNA 的電泳結(jié)果顯示(圖1)，在15 000 bp以上位置出現(xiàn)整齊明亮的條帶，說明基因組DNA 完整性好，沒有降解，可作為PCR 擴(kuò)增模板。

2.2霸王18S rRNA 基因序列的擴(kuò)增和克隆 以霸王的總DNA 為模板，使用18S rRNA 的通用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)約在1 800 bp處有一條亮帶(圖2)，與預(yù)測的目的片段大小一致，推測可能是霸王18S rRNA 基因片段。

圖1 霸王總DNA的凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total DNA of Zygophyllum xanthoxylum

圖2 18S rRNA 基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 PCR product of 18S rRNA gene fragment

將回收純化的目的片段連接到pGEM-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從轉(zhuǎn)化的平板上隨機(jī)挑取3個(gè)克隆并提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,得到的擴(kuò)增片段大小約為1 800 bp(圖3)。表明這些克隆為陽性克隆,可以進(jìn)行測序。

圖3 陽性克隆的PCR鑒定凝膠電泳圖Fig.3 Positive clones electrophoresis of product by PCR

2.3測序結(jié)果及序列分析 測序結(jié)果顯示，該序列長度為1 808 bp。Blast 比較結(jié)果(圖4)表明，該片段與其他植物的18S rRNA 基因核苷酸序列的同源性均在96%以上，其中與之同源性最高的是驅(qū)蟲莧(98%)、小盤木(98%)和橡膠樹(98%)，表明所克隆到的片段為18S rRNA 基因片段，且進(jìn)一步證明18S rRNA 是一種高度保守的基因。將該基因命名為Zx18S rRNA。

同源性分析(表1)與Blast 比較結(jié)果基本相一致，霸王與小盤木、驅(qū)蟲莧及橡膠樹同源性最高。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖5)表明，霸王與三七(Panaxnotoginseng)的親緣關(guān)系最近。

圖4 Zx18S rRNA 與其他植物18S rRNA 基因核苷酸序列Blast比對部分結(jié)果Fig.4 Zx18S rRNA and 18S rRNA from other plants sequences producing significant alignments by Blast

表1 Zx18S rRNA與其他植物18S rRNA基因核苷酸序列同源性分析Table 1 Homology matrix of Zx18S rRNA and 18S rRNA from other plants %

圖5 Zx 18S rRNA與其他植物18S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of Zx 18S rRNA and 18S rRNA from other plants

3 討論

在真核生物分類和進(jìn)化分子生物學(xué)的研究中，研究者將重點(diǎn)放在rRNA基因上，該基因編碼核糖體結(jié)構(gòu)RNA。真核生物有4種rRNA，它們的分子大小分別是5S、5.8S、18S和28S，分別具有大約120、160、1 900和4 700個(gè)核苷酸[22]。其中，18S rRNA作為編碼核糖體RNA的基因在植物生命活動過程中起著重要的作用[3]。前人研究[4-8]表明，18S rRNA基因在核苷酸水平上具有高度的保守性和同源性。本研究得到的霸王18S rRNA 基因片段與其他植物18S rRNA基因核苷酸序列的同源性均在96%以上。由此可見，高等植物18S rRNA的基因非常保守。

生長在荒漠區(qū)的多漿旱生植物霸王具有極強(qiáng)的抗逆性，若要深入研究其抗逆基因資源，則要了解霸王的遺傳背景。但是在GenBank數(shù)據(jù)庫中未能搜索到有關(guān)多漿旱生植物如霸王、白刺(Nitrariatangutorum)的18S rRNA 基因序列，本研究結(jié)果填補(bǔ)了此空白，同時(shí)豐富了18S rRNA 基因研究的資料庫。18S rRNA基因的核苷酸變異小，被認(rèn)為最有希望成為解決早期動物、植物及微生物進(jìn)化型式的工具[2]，因此，分離某一物種18S rRNA 基因并測序，就可以從不同生物的18S rRNA 的對比中得出關(guān)于生物進(jìn)化歷程的結(jié)論。本研究表明，與霸王18S rRNA基因同源性最高的驅(qū)蟲莧(98%)、小盤木(98%)和橡膠樹(98%)均為熱帶或亞熱帶物種，恰與霸王物種起源地為非洲[11]相吻合。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，霸王與三七處于同一分支上，三七起源于第三紀(jì)，屬古熱帶殘遺植物[23]，與霸王背景相似。但是，霸王從非洲遷移到亞洲，并主要分布在我國西北荒漠草原的原因仍需進(jìn)一步探究。因此，本研究結(jié)果可為霸王進(jìn)化和分子系統(tǒng)學(xué)研究提供序列參考，將有助于進(jìn)一步揭示霸王這類抗逆性極強(qiáng)的古老荒漠殘遺植物的進(jìn)化歷程及區(qū)系起源。

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