謝 越，楊高文，周翰舒，張英俊

(中國農業(yè)大學草地研究所，北京 100193)

植物與叢枝菌根真菌(AMF)共生現(xiàn)象在自然界中分布十分普遍。從1885年第1篇關于菌根的研究到現(xiàn)在，人們對這種共生關系的探索還在不斷進行中[1]。在植物生長過程中，AMF會影響幼苗建植[2-3]、植物生長[4-5]和繁殖[6]。很多研究指出，AMF可以提高植物對養(yǎng)分的吸收[7-10]，影響水分的代謝[11]，提高植物的產量[12-15]，改善作物品質[16-17]，增加植物抗性[18-22]。從生態(tài)學角度上來看，不同植物對不同AMF的依賴性不同，導致植物間競爭力發(fā)生改變，從而影響到植物群落的多樣性[23-24]。與此同時，植物也會作用于AMF并影響AMF的生物量和多樣性[25-26]，而植物根系分泌物可以促進根系周圍的AMF菌絲分支[27]。如今，美國、澳大利亞以及歐洲不僅在植物個體水平上對AMF進行研究，也擴展到了植物群體水平上，而我國在植物群體水平上的研究還相對匱乏[28]。

在AMF研究中，無AMF對照是研究AMF作用的關鍵，因為只有通過與無AMF條件下植物的生長反應相比較，才能反映AMF對植物的作用。在對土壤進行滅菌的過程中，最理想的狀態(tài)是獲得在滅菌過程中沒有引起任何土壤理化性質變化，并且殺滅了所有AMF的滅菌土壤[29]。只有在這樣的滅菌土壤中進行試驗，才能不引入對試驗結果產生干擾的其他因素。歐美國家對已有的建立無AMF的方法進行了探究[30-31]，而我國缺乏對其方法的研究。現(xiàn)有方法或多或少都會對土壤理化性質以及土壤微生物群落產生影響。本研究將對現(xiàn)在常用的幾種設置無AMF對照的方法進行綜述，旨為研究者根據目的選擇適宜的方法提供依據。

1 常用方法

目前，在AMF研究中，常根據試驗條件將滅菌方法分為室內滅菌法和室外滅菌法。室內滅菌法包括高溫滅菌法、γ射線滅菌法和化學熏蒸法。高溫滅菌法是通過高溫來殺滅土壤中的微生物，從而達到無菌狀態(tài)；γ射線滅菌法是依據γ射線能量高、穿透力強的特點，采用Co60放射出γ射線，使細胞內各種活性物質例如DNA之間的C-C鍵發(fā)生斷裂，從而達到殺死土壤微生物的目的；化學熏蒸法常采用化學試劑(如氯仿、甲醛或甲基溴)對土壤進行熏蒸，從而殺滅土壤生物。室外滅菌法包括殺真菌劑苯菌靈抑制法和物理割斷法。苯菌靈是一種廣譜、高效的內吸性殺真菌劑，它通過抑制真菌的細胞分裂來達到滅菌效果；物理割斷法是將丙烯腈-苯乙烯-丁二烯(ABS)管的管外四周開4個孔，然后用孔徑為35 μm的篩子封住管孔及管底，使植物根部無法通過網篩而細菌等可以通過。然后將管埋入野外試驗地中，每周旋轉管45°以切斷進入管內的外源菌絲。

各種方法都有自己的優(yōu)點和缺點以及不同的適用條件，表1為常用幾種方法的比較。在實際應用中，應根據具體情況選擇對土壤和環(huán)境影響較小的方法。

表1 常用建立無AMF對照方法比較

2 室內滅菌法

2.1高溫滅菌法 高溫滅菌通常在120 ℃下滅菌30 min到4 h不等。有研究指出[30]，采用高溫滅菌對土壤進行滅菌的最短時間為20～30 min，時間越長給土壤帶來的傷害越大。Darbar和Lakzian[31]報道了高溫滅菌、化學熏蒸、微波滅菌以及紫外線滅菌幾種滅菌方式對土壤微生物和化學性質的影響，發(fā)現(xiàn)上述方法中高溫滅菌法對減少微生物量作用最好。

高溫滅菌法會影響土壤的理化性質(pH值、陽離子含量、團聚體等)[30,32-33]和生物特性(呼吸作用)。由于高溫滅菌法改變了土壤的理化、生物性質，那么勢必產生對植物的毒副作用，因此一般經過高溫滅菌的土壤需要放置一段時間，以使土壤里可揮發(fā)的毒素釋放出來。對于毒副作用產生原因的說法各不相同。有學者對高溫滅菌土壤的營養(yǎng)元素進行分析發(fā)現(xiàn)，滅菌后土壤中可溶性錳含量會增加[33-35]，并認為這是植物毒副作用形成的原因。Wolf等[36]在對不同土壤類型的試驗中還發(fā)現(xiàn)錳含量增加了5倍而鐵的含量卻下降了。Rovira 和Bowen[37]在其試驗中采用土壤洗出液培養(yǎng)植物，發(fā)現(xiàn)毒副作用主要來源于可溶性的物質，并認為土壤對植物的毒副作用可能是來自于有毒的有機物的形成；Darbar和Lakzian[31]也認為對土壤理化性質的改變來源于可溶性有機酸的釋放。然而Smith和Smith[35]通過將高溫滅菌和沒有處理過的土壤混合之后與沒有處理的土壤進行比較，發(fā)現(xiàn)高溫滅菌土壤不存在對植物生長以及菌根真菌侵染的影響。

許多研究提出接種微生物(真菌和細菌)可以減輕高溫滅菌所引起的土壤對植物的毒副作用[37]。Al-Khaliel[38]采用花生(Arachishypogaea)為材料報道了施用土壤微生物提取液可以促進AMF的孢子形成和對花生的侵染率，從而促進了花生的生長。然而，Manian等[39]對番茄(Lycopersiconescwlentum)生長與AMF的關系中卻得出了相反的結論。盡管目前關于土壤其他微生物對AMF的作用機理以及相互作用還未研究清楚，但是其他微生物會干擾AMF的表現(xiàn)和生態(tài)生產力是肯定的[40]。因此，在對AMF與植物的關系研究中，設計無菌根真菌對照試驗時，滅菌土壤應該加入篩除了AMF的土壤浸提液，以消除缺少其他微生物對試驗結果的影響。

由于高溫滅菌法殺滅了土壤中所有微生物，因此可用于原生土壤中AMF群落對植物影響的研究，也可以通過滅菌之后再接種特定菌種來研究特定AMF菌種或菌群與植物的關系。在許多研究中還可以看到高溫滅菌法對AMF的滅菌作用是很有效的。但高溫帶來的毒副作用是無法避免的，因此，減少毒副作用對試驗結果的干擾是試驗設計中不可忽視的一個環(huán)節(jié)。很多研究者在研究中采取滅菌土與接種結合的對照來減小毒副作用的干擾，同時滅菌后土壤應敞開放置一段時間來釋放其中的有毒物質?？偟膩碚f，高溫滅菌法存在一些不足，但由于其操作簡單、成本低，仍然在菌根研究中被廣泛應用。由于其操作條件的限制，該方法較為適用于室內試驗，對野外試驗來說并不可取。

2.2γ射線滅菌法 有些AMF試驗也會采用γ射線滅菌法[41-42]。采用不同劑量的輻射，將會產生不同的滅菌效果[43-45]。例如，大多數土壤在放射量為10 kGy時會減少放線菌、真菌和無脊椎動物的量；在20 kGy時，主要的細菌就會死去；當放射量增加到70 kGy時，具有抗輻射能力的細菌也會死去。γ射線滅菌法的優(yōu)點在于，它采用的是低溫滅菌方式，所以排除了高溫給土壤帶來的傷害，因此許多學者認為它是最有效的滅菌方式。

γ射線滅菌法會引起土壤一些化學性質的改變。但許多研究指出，它對土壤的理化性質和生物活性影響小于高溫滅菌方式[46-48]。McLaren等[49]指出γ射線滅菌后的土壤仍然存在著酶活性并且該土壤對番茄是沒有毒性的。Salonius等[32]對高溫滅菌和γ射線滅菌兩種方式對土壤理化性質進行了比較，結果顯示γ射線滅菌法對可溶性有機物和電解質的影響小于高溫滅菌法，且經γ射線滅菌后的土壤其微生物要比高溫滅菌土壤中生長得更好。γ射線滅菌法會影響土壤的化學性質，例如硝態(tài)氮與銨態(tài)氮的比例[46]。McNamara等[44]通過對ISI(Institute for Scientyfic Infomation)數據庫過去50年的相關文獻考證發(fā)現(xiàn)，γ射線滅菌法是相比于高溫滅菌法、化學滅菌法的一種高效的、沒有化學污染的滅菌方法，并提出風干土壤后進行滅菌處理可穩(wěn)定土壤的化學性質。同時，對比γ射線滅菌后接種AMF的土壤與沒有處理過的土壤，發(fā)現(xiàn)前者的效果比后者低5%，這可能是由于滅菌導致的土壤營養(yǎng)元素改變造成的。但是，γ射線滅菌法由于成本高，需要專業(yè)人員操作以及其操作的安全性，在以往的研究中此法的采用不及高溫滅菌法普遍。

γ射線滅菌除了對土壤中原生AMF群落與植物關系的研究外，同樣也可以通過滅菌后再接種來研究特定AMF菌種或群落和植物關系?，F(xiàn)在，γ射線滅菌方法對土壤性質產生的影響是否會引起對植物的毒副作用還尚無定論。同時，由于γ射線滅菌法滅菌時對其他微生物群落也有所影響，因此在對土壤原生AMF研究的試驗設計中，設計滅菌土與接種的對照以及施以不含AMF的土壤浸提液是很有必要的。γ射線滅菌法雖然對土壤的影響小于高溫滅菌法，但由于操作條件的安全性以及高成本，它也不適用于野外試驗。

2.3化學熏蒸法 Brookes等[50]指出，氯仿熏蒸增加了土壤中銨和有機碳的含量。但Darbar和Lakzian[31]在研究中指出，化學熏蒸法對土壤的傷害介于高溫滅菌法和γ射線法之間。很多科學家對化學熏蒸法都提出了具體的操作指導[51]。但由于各種化學試劑本身的理化性質和毒性，熏蒸法都需要對熏蒸后土壤進行通氣，以減少化學試劑在土壤中的殘留以及對土壤的傷害?；瘜W熏蒸法操作比以上兩種方法簡單，且滅菌效果也不錯，許多研究者都采取此方法來獲得無AMF的對照組[52-53]。但是，由于化學試劑的毒性以及對環(huán)境的污染作用，例如甲基溴會分解出溴，這對臭氧層有破壞作用，導致現(xiàn)在很多人對化學熏蒸法并不提倡，并且許多方法在國外已經被禁止使用。因此，本研究將不對該方法進行詳細描述。

3 室外滅菌法

由于上述方法在操作上的局限性，所以它們在室內盆栽試驗時更為適用。但盆栽試驗在試驗環(huán)境上與真實的環(huán)境相差很大，其試驗結果并不能真實代表AMF在環(huán)境中的作用。在進行野外試驗時，需要操作更為簡單、工作量小的方法。因此，將介紹以下兩種在野外試驗中常用的方法。

3.1苯菌靈抑制法 苯菌靈是目前AMF原位試驗中最常用的滅菌方法。在我國AMF的研究中，也有學者將該法用于室內盆栽試驗以獲得低AMF處理[54]。苯菌靈的施用量以及施用頻率將決定其滅菌效果，而Pedersen和Sylvia[55]認為苯菌靈的滅菌效果也與施用時間有關?；谏鲜鰶Q定因素，Kahiluoto等[45]對土壤取樣時間和苯菌靈施用量進行了研究，他指出苯菌靈的施用量為20 mg·kg-1土壤時足以創(chuàng)建一個無AMF的對照，而最有效的苯菌靈施用時間是在播種前。同時，苯菌靈的降解速度也會影響其對AMF的抑制作用，降解速度會受到微生物活動以及水分含量的影響，在無植物栽培的土壤中苯菌靈一些分解物的半衰期從2周到7周不等[56]?，F(xiàn)在，大多數試驗多采取每2～3周施用一次苯菌靈來降低苯菌靈的失效[57-58]。O’Connor等[58]發(fā)現(xiàn)，苯菌靈對AMF的抑制作用也會隨著苯菌靈施用的深度而降低。Karanika等[23]提到，苯菌靈對于AMF的侵染的抑制作用可能會因為植物群落的不同而發(fā)生變化。Pedersen和Sylvia[55]也指出，苯菌靈對AMF的抑制作用也會因為菌種的不同而有所差異。

Hartnett和Wilson[59]、Smith等[60]都認為施用苯菌靈對于野外試驗來說非常有用，并且Hartnett和Wilson[59]認為在野外試驗中施用苯菌靈優(yōu)于其他方法。苯菌靈被認為是最好的殺菌劑，因為它能有效減少AMF的侵染[61-63]，并對植物和其他非目標生物的副作用最小[64]。O’Connor等[58]報道，反復施用苯菌靈只會稍微增加土壤毒性；Kahiluoto和Vestberg[65]也通過試驗證明，施用苯菌靈不會產生植物毒素。Hartnett和Wilson[59]指出苯菌靈對土壤的營養(yǎng)元素N的影響小于γ射線滅菌法且不會升高土壤P的含量[66]。但是，苯菌靈并不是在所有試驗中都有良好的抑制表現(xiàn)[67]。近年來，出現(xiàn)了苯菌靈的一些替代殺菌劑，例如托布津和多菌靈。有研究報道，托布津對AMF侵染有抑制作用，但并沒有提出它可以成為有效的苯菌靈的替代物[68]。因此，苯菌靈依然是使用最為廣泛的殺真菌劑。

據報道，施用苯菌靈可能會對土壤性質和其他生物造成影響。Welsh等[69]通過對施用苯菌靈的土壤進行測定，發(fā)現(xiàn)施用苯菌靈的土壤比無處理的土壤的pH值低而氧化還原能力強，這樣可以抑制AMF的呼吸作用，從而達到抑制AMF活性的作用。由于苯菌靈的生物毒性，苯菌靈可能對寄生真菌[70]和線蟲有抑制作用，如果苯菌靈對病原微生物和線蟲有影響，那么施用苯菌靈可能會促進植物的生長，從而干擾試驗結果。與此相反，有人提出苯菌靈對其他非目標生物，如藻類或細菌的抑制作用很小[71]。Fitter和Nichols[64]以及Hartnett和 Wilson[59]也提出苯菌靈主要作用于AMF。雖然苯菌靈在對AMF的抑制作用上表現(xiàn)不錯，但它和化學熏蒸法一樣對環(huán)境有一定的破壞作用[72]。

盡管存在以上還未經證實的問題，但是由于其操作方便且對AMF抑制作用效果較好，苯菌靈抑制法仍然被大多數人所認可并廣泛應用于野外試驗中[62,73-74]。但是，如何施用苯菌靈才能穩(wěn)定并提高苯菌靈對AMF的抑制作用，減少其對環(huán)境的影響，目前還沒有一個具體的指導。在今后的研究中，如何減少AMF對其他微生物潛在的抑制作用是試驗設計中需要考慮的因素。由于苯菌靈屬于內吸性殺真菌劑，是否可以在試驗前幼苗建植時就對植物施以苯菌靈，從而達到減輕對其他生物的影響可以在以后的研究中進行探討。此外，尋找一種新的、對AMF專一性更好的苯菌靈替代物也是解決問題的一個方法。

3.2物理割斷法 如何實施野外試驗且對環(huán)境無害是許多學者迫切想解決的問題。根據多年對AMF的研究，Johnson等[75]設計了一種利用物理原理來設置無AMF環(huán)境的方法：采用內徑為18 mm、外徑為2 mm的ABS管，在管外四周開4個窗戶，總面積大約為管外表面積的50%，然后將孔徑為35 μm的篩子粘到管內以及管底，使得植物根部無法通過網篩而細菌等可以通過，在試驗中將滅好菌的土壤填入管中，然后將管埋入野外試驗地中，并每周將管旋轉45°以切斷外源菌絲進入管內。這個裝置需要注入事先滅好菌的土，因此仍然會存在其他滅菌方法帶來的危害。

這個方法優(yōu)于其他方法的地方在于，在原位試驗中，它可以保證植物在無菌土壤中生長的同時還可以與外界環(huán)境進行營養(yǎng)元素和水分的交換，使試驗可以在更接近真實的自然條件下進行。同時，試驗證實該方法將AMF侵染率從55%降低到了10%[75]。在隨后的研究中，許多學者對該方法進行了一些細微的改變，使得該方法可以用于AMF的其他研究方向中。例如，Johnson等[76]將這個方法運用于AMF對營養(yǎng)元素的轉運研究中；Cheng和Baumgartner[77-78]通過此法切斷葡萄(Vitisvinifera)藤和金花菜(Medicagohispida)之間的菌絲，進而研究了兩種植物間的氮素轉換；Nottingham等[79]和Moyano等[80]都根據物理隔斷方法研究了菌根呼吸作用；Duan等[81]采用此法研究了土壤擾動和植物殘留物對AMF侵染和菌絲生長的影響。

但是，Johnson[75]同時提出這個方法也會導致破壞土壤與網篩界面上的團聚體以及降低這個區(qū)域土壤的孔隙度，會對PVC管與周圍環(huán)境的水分和營養(yǎng)元素交換造成一定的影響。然而，采用這個方法展開原位試驗不用擔心像化學方法一樣帶來的環(huán)境問題，且可以有效控制AMF的侵染。

4 總結與展望

從以上綜述可以看出，在今后的研究中應根據不同的研究對象采用不同的滅菌方法。高溫滅菌法和γ射線滅菌法由于殺滅了土壤中所有的生物，因此可通過外緣接種AMF來研究特定真菌或菌群與植物關系；而化學熏蒸法、苯菌靈抑制法和物理割斷法一般用于土壤原生AMF的研究。

同樣，不同的試驗條件也應采取不同的滅菌方法。在室內試驗中，γ射線滅菌法比高溫滅菌法對土壤理化性質影響較小。因此，在條件允許的情況下，γ射線滅菌法比高溫滅菌法所帶來的對土壤的影響更小，從而對試驗結果的干擾更小更好，但兩種方法由于操作限制不太適用于野外試驗；化學熏蒸法的滅菌效果不錯，但是其污染性使其備受爭議。在室外試驗中，苯菌靈抑制法可能會影響到土壤中其他生物，但對土壤理化性質影響較小，且其抑制效果不穩(wěn)定。物理割斷法對其他微生物和環(huán)境沒有影響，但其可能會在網篩界面和土壤之間形成孔隙，從而影響水分和營養(yǎng)元素的交換。

由于人們對AMF研究興趣的日益濃厚，相信不久的將來上述方法將得到改進。在以后的試驗設計中，減少或避免這些因素對試驗的干擾是必須考慮的。高溫滅菌法和γ射線滅菌法可以通過加入土壤浸提液來減輕對土壤微生物的影響，但不能避免其對土壤理化性質的影響；在苯菌靈抑制法中，若要使滅菌效果有效且不對環(huán)境造成傷害，必須在試驗前進行預試驗，嚴格確定苯菌靈的施用量和頻率。另外，提高苯菌靈的內吸性或在幼苗期使用苯菌靈，或許可以減少苯菌靈的用量，但這需要進一步驗證。同時，尋找對環(huán)境無影響的苯菌靈替代品，或研發(fā)可通過植物葉片吸收的、對植物和環(huán)境無害的化學試劑則可避免對土壤生物和環(huán)境的負面影響。物理割斷法在旋轉時會產生空隙從而影響物質的交換，可對試驗裝置進行改進以減少旋轉所產生的空隙。總的來說，尋找能抑制AMF的活性、新型環(huán)保的化學試劑是改進滅菌方法發(fā)展新趨向，這將對室內室外試驗都有很大的促進作用，這將進一步推動叢枝菌根真菌的研究。

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