王 茜，王 沛，王鎖民

(蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院 草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

Na+是廣泛存在于土壤以及土壤溶液中的元素。但是，不論甜土植物還是鹽生植物，其細胞質(zhì)酶都對Na+有高度的敏感性[1-3]。過量的Na+會對植物生長產(chǎn)生各種不利影響，甚至導致植物死亡[4]。鹽生植物在進化過程中，形成了特殊的耐鹽機制，對其耐鹽機理研究以及耐鹽相關(guān)功能基因的挖掘在農(nóng)作物和優(yōu)良牧草耐鹽性的遺傳改良方面有十分重要的應(yīng)用價值。

小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)為禾本科堿茅屬多年生牧草，耐鹽堿，能夠在高濃度的Na+環(huán)境下維持體內(nèi)很低的Na+水平[5-8]。Wang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，小花堿茅具有極強的K+/Na+選擇性運輸能力，從而能夠在鹽脅迫下維持地上部穩(wěn)定的高K+含量，可見，限制Na+內(nèi)流，同時提高地上部K+的積累，進而維持植株體內(nèi)高的K+/Na+是增強植物耐鹽性的關(guān)鍵[10]。研究表明，K+在植物地上部的積累主要是通過將根部吸收的K+經(jīng)木質(zhì)部裝載，在蒸騰拉力作用下，隨木質(zhì)部流進入地上部完成的，外整流K+通道在此運輸過程中發(fā)揮重要作用[11]。

外整流K+通道屬于Shaker通道家族，目前針對它的研究涉及甚少。Wegner和Raschke[12]通過膜片鉗技術(shù)在大麥(Hordeumvulgare)根離體的木質(zhì)部薄壁細胞的原生質(zhì)體中首次發(fā)現(xiàn)了外整流K+通道的活性，將其稱為KORC(K+-selective Outwardly Rectifying Conductance)。隨后，在玉米(Zeamays)根皮層及中柱細胞中也檢測到了外整流K+通道，并確定其介導K+從中柱細胞外排到木質(zhì)部汁液中[13-14]，這一功能在大麥中也得到了驗證[13]。Gaymard等[11]從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中首次克隆到編碼外整流K+通道的基因，并發(fā)現(xiàn)其在根中柱組織特異表達，且能被ABA抑制，將其命名為SKOR(Stelar K+Outward Rectifier)，在突變體中的研究也證實了SKOR的上述功能。由此猜測，在小花堿茅體內(nèi)，外整流K+通道SKOR可能在維持其體內(nèi)高的K+/Na+，進而在提高植株耐鹽性中發(fā)揮重要作用。本研究采用RT-PCR方法克隆拒鹽型鹽生植物小花堿茅SKOR基因片段并分析其序列特征，以期為小花堿茅SKOR基因全長的克隆、表達調(diào)控、RNAi等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗材料 植物材料為4周齡小花堿茅幼苗，種子采自甘肅省張掖市臨澤縣。大腸桿菌DH5α菌株為草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)國家重點實驗室保存。

1.2研究方法

1.2.1材料培養(yǎng) 參照王生銀等[15]的方法。挑選籽粒飽滿的小花堿茅種子播種在鋪有吸水紙的篩網(wǎng)架上，然后置于白瓷盤中暗培養(yǎng)，25 ℃，澆蒸餾水發(fā)芽，約7 d后澆灌Hoagland營養(yǎng)液(5 mmol·L-1KNO3，0.5 mmol·L-1NH4H2PO4，0.25 mmol·L-1MgSO4·7H2O，1.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，0.5 mmol·L-1Fe-citrate，92 μmol·L-1H3BO3，18 μmol·L-1MnCl2·4H2O，1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.6 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O )。營養(yǎng)液約5 d更換一次。培養(yǎng)室晝/夜溫度為(28±2) ℃/(23±2) ℃，光照16 h·d-1，光強約為600 μmol·m-2·s-1，空氣相對濕度為60%～80%。

1.2.2總RNA的提取 參照王生銀等[15]的方法。將4周齡小花堿茅幼苗經(jīng)25 mmol·L-1NaCl與10 mmol·L-1KCl處理48 h，取其根系，加入液氮研磨至粉末狀，按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的操作說明書提取根系總RNA。用1.0%甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性和質(zhì)量。

1.2.3引物的設(shè)計與合成 參照王生銀等[15]的方法。通過對其他植物SKOR核苷酸序列進行同源性比較，找出高度保守的區(qū)段，根據(jù)同源性高和簡并性低的原則，利用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計一對簡并性引物P1和P2，用于擴增小花堿茅SKOR基因片段，推測目的片段的長度為566 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

P1：5′-TACCTG(A/G)TCGG(C/G)AACATGACGGCG-3′；

P2：5′-GATGCT(A/G)GTCA(A/G)GGA(C/T/U)TGCTTGTC-3′。

1.2.4RT-PCR擴增 參照王生銀等[15]的方法。PCR擴增反應(yīng)體系：在200 μL PCR管中依次加入10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol·L-1MgCl23 μL、2 mmol·L-1dNTP 5 μL、10 μmol·L-1P11 μL、10 μmol·L-1P21 μL、5 U·μL-1Taq DNA polymerase 0.5 μL、cDNA 4 μL，加純水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測，目的片段的回收和純化按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒操作說明進行。

1.2.5陽性克隆的篩選與鑒定 參照王生銀等[15]的方法。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基進行藍白斑篩選，轉(zhuǎn)化白斑菌株經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定確認陽性克隆后，送至北京華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.6序列分析 參照王生銀等[15]的方法。序列的比較、翻譯等在DNAMAN生物軟件上進行，Blast搜索在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)網(wǎng)站上進行。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR擴增 以總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的第一鏈cDNA為模板，用SKOR基因的簡并性引物P1和P2進行PCR擴增(圖1)。擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)約在560 bp處有一條亮帶，且上下無雜帶，與目的片段的大小一致，推測可能是小花堿茅SKOR基因片段。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

圖2 陽性克隆的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of positive clones

2.2陽性克隆的鑒定 將回收純化的目的片段連接到pUCm-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從轉(zhuǎn)化的平板上隨機挑取4個白色菌斑并提取質(zhì)粒，進行PCR擴增，得到的擴增片段大小約為560 bp(圖2)，與RT-PCR結(jié)果一致，表明這些克隆為陽性克隆。

2.3SKOR基因片段序列分析 測序結(jié)果顯示，該陽性克隆序列長度為555 bp，推測其編碼185個氨基酸(圖3)。Blast 比較結(jié)果表明，該片段與玉米(AY899 922.1)、擬南芥(NM_111 153.3)、葡萄(Vitisvinifera)(AJ490 336)、蓖麻(Ricinuscommunis)(XM_002 533 405)和胡楊(Populuseuph-ratica)(EU382 997.1)等植物外整流K+通道基因的核苷酸序列的同源性均在66%以上，與禾本科模式植物水稻(Oryzasativa)推測的外整流K+通道基因的(GQ355 585.1)核苷酸序列的同源性最高，達到82%。表明本研究克隆到的片段為外整流K+通道基因片段，將其命名為PtSKOR。

圖3 小花堿茅PtSKOR核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequence of PtSKOR fragment from Puccinellia tenuiflora

多重比較及系統(tǒng)進化分析表明，小花堿茅PtSKOR片段與禾本科植物水稻推測的外整流K+通道OsSKOR(ADF28 806.1)的進化關(guān)系非常近，氨基酸同源性高達83%；與其他單子葉植物如玉米ZKOR(AM746 987.1)的進化關(guān)系相對較遠，同源性為61%；與雙子葉植物如擬南芥AtSKOR(NP_186 934.1)、葡萄VvSOR(CAD35 400.1)、胡楊PeORK(ABY86 890.1)、蓖麻RcSKOR(XP_002 533 451.1)等同源性分別為61%、60%、55%和55%(圖4、圖5)。序列比對及疏水性分析表明，本研究得到的小花堿茅PtSKOR片段的氨基酸序列起始于最后一個跨膜區(qū)(S6)中段，與非跨膜區(qū)相比，該跨膜區(qū)在結(jié)構(gòu)上高度保守(圖3、圖4)。

圖4 PtSKOR氨基酸序列與其他植物SKOR氨基酸序列的多重比較Fig.4 Amino acid sequence alignment of PtSKOR with those from other plants

圖5 PtSKOR蛋白質(zhì)序列與其他植物外整流K+通道的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of PtSKOR and outward rectifier K+ channel from other plants

3 討論

長期以來，有關(guān)外整流K+通道蛋白的研究主要集中在模式植物擬南芥上?？茖W家們在擬南芥中提出的假說認為，鹽脅迫下，隨著木質(zhì)部薄壁細胞中Na+不斷積累，引起薄壁細胞質(zhì)膜去極化，激活外整流K+通道蛋白(SKOR)或非選擇性離子外整流通道蛋白(NOR)活性，進而將K+裝載到木質(zhì)部向地上部運輸[14，16]。Gaymard等[11]從擬南芥中分離到K+外整流通道蛋白基因AtSKOR，通過非洲爪蟾卵母細胞(Xenopusoocytes)異源表達和突變體atskor試驗證明，AtSKOR介導K+從木質(zhì)部薄壁細胞向木質(zhì)部的裝載?？梢姡琒KOR在植物地上部K+積累方面的作用不容忽視。Wang等[9]在拒鹽牧草小花堿茅中的研究證明，其地上部K+的含量不受外界鹽分濃度及處理時間的影響，并維持植株地上部高的K+/Na+。由此推測，小花堿茅PtSKOR作為外整流K+通道，對其耐鹽性發(fā)揮著重要作用。

本研究得到的PtSKOR片段與擬南芥、葡萄、胡楊、蓖麻等雙子葉植物的外整流K+通道相比同源性較低，介于55%～61%；與單子葉植物水稻推測的外整流K+通道OsSKOR同源性達到83%，但與其內(nèi)整流K+通道AKT1同源性僅為33%(圖5)，因此推測此通道為小花堿茅外整流K+通道。PtSKOR與玉米ZORK同源性卻僅有61%，這可能是由于玉米ZORK基因主要表達于根外皮層及保衛(wèi)細胞中[17]，與已知的其他植物的外整流K+通道分屬不同類。

植物外整流K+通道SKOR結(jié)構(gòu)與KAT1、AKT1等內(nèi)整流K+通道類似，具有6個疏水性跨膜區(qū)域(S1～S6)[11]。本試驗克隆獲得的PtSKOR片段起始于最后一個跨膜區(qū)(S6)中段。S6跨膜區(qū)及其細胞內(nèi)擴展區(qū)域具有高度的序列保守性(圖4)，與通道阻斷劑的相互作用是K+通道電壓門控的重要機制[18]。此外，PtSKOR與已報道的AtSKOR一致，在近C端含有環(huán)核苷酸結(jié)合序列(Cyclin Nucleotide-Binding Site,CNBS)，與環(huán)核苷酸的調(diào)控有關(guān)[19]。然而，各類K+通道在C端的結(jié)構(gòu)差異較大，如KAT1與SKOR在跨膜區(qū)具有很高的同源性，但C端比SKOR少約200個氨基酸及6個錨蛋白重復基序(Ankyrin Repeat Motif,AR)[20-21]。因此，KAT1對于細胞內(nèi)的K+沒有響應(yīng)，而SKOR的C端非跨膜區(qū)對于其感受細胞內(nèi)K+信號起著關(guān)鍵作用?？梢?，PtSKOR基因的研究為闡明鹽生植物小花堿茅K+、Na+選擇性運輸機制提供分子層面的依據(jù)，對于改良作物耐鹽堿性奠定了理論基礎(chǔ)。

[1] Flowers T J，Troke P F，Yeo A R．The mechanism of salt tolerance in halophytes[J]．Annual Review Plant Physiology，1997，28：89-121．

[2] Flowers T J，Hajibagheri M A，Clipson N J W． Halophytes[J]．The Quarterly Review of Biology，1986，61：313-337．

[3] Greenway H，Munns R．Mechanisms of salt tolerance in nonhalophytes[J]．Annual Review of Plant Physiology，1980,31：149-190．

[4] Pardo M J，Quintero F J．Plants and sodium ions:Keeping company with the energy[J]．Genome Biology，2002(3)：1017-1021．

[5] 王鎖民，朱興運，舒孝喜．堿茅離子吸收與分配特性的研究[J]．草業(yè)學報，1994，3(1)：39-43．

[6] 朱興運，王鎖民，閻順國，等．堿茅屬植物抗鹽性與抗鹽機制的研究進展[J]．草業(yè)學報，1994，11(3)：9-15．

[7] 李劍，趙常玉，吳永娜，等．小花堿茅HKT1;4基因片段的克隆與序列分析[J]．草業(yè)科學，2011，28(6)：969-973．

[8] 任偉，王志峰，徐安凱．堿茅耐鹽堿基因克隆研究進展[J]．草業(yè)學報，2010，19(5)：260-266．

[9] Wang C M，Zhang J L，Liu X S，etal．Puccinelliatenuifloramaintains a low Na+level under salinity by limiting unindirectional Na+influx resulting in a high selectivity for K+over Na+[J]．Plant，Cell and Environment，2009，32：486-496．

[10] Zhu J K．Regulation of ion homeostasis under salt stress[J]．Current Opinion in Plant Biology，2003(6)：441-445．

[11] Gaymard F，Pilot G，Lacombe B，etal．Identification and disruption of a plant shaker-like outward channel involved in K+release into the xylem sap[J]．Cell，1998，94：647-655．

[12] Wegner L H，Raschke K．Ion channels in the xylem parenchyma of barley roots:A procedure to isolate protoplasts from this tissue and a patch-clamp exploration of salt passageways into xylem vessels[J]．Plant Physiology，1994，105：799-813．

[13] Roberts S K，Tester M．Inward and outward K+-selective currents in the plasma membrane of protoplasts from maize root cortex and stele[J]．The Plant Journal，1995，8：811-825．

[14] Roberts S K，Tester M．Permeation of Ca2+and monovalent cations through outwardly rectifying channel in maize root stelar cells[J]．Journal of Experimental Botany，1997，48：839-846．

[15] 王生銀，馬清，王鎖民.鹽生植物鹽地堿蓬質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因片段的克隆及其序列分析[J].草業(yè)科學,2012,29(6):918-923．

[16] Wegner L H，De Boer A H．Properties of two outward-rectifying channels in root xylem parenchyma cells suggest a role in K+homeostasis and long-distance signaling[J]．Plant Physiology，1997，115：1707-1719．

[17] Büchsenschütz K，Marten I，Becker D，etal．Differential expression of K+channels between guard cells and subsidiary cells within the maize stomatal complex[J]．Plant Physiology，2005，222：968-976．

[18] Ding S，Horn H．Effect of S6 tail mutations on charge movement in shaker potassium channels[J]．Biophysical Journal，2003，83(1)：295-305．

[19] Chérel I，Daram P，Gaymard F，etal．Plant K+channels：Structure activity and function[J]．Biochemical Society transactions，1996，24：964-971．

[20] M?ser P，Thomine S，Schroeder J I，etal．Phylogenetic relationships within cation transporter families ofArabidopsis[J]．Plant Physiology，2001，126：1646-1667．

[21] Zimmermann S，Sentenac H．Plant ion channels：From molecular structures to physiological functions[J]．Current Opinion in Plant Biology，1999(2)：477-482．