鄭曉輝，巴特爾·巴克*，海利力·庫爾班，茹鮮·木沙，劉珊珊

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052）

植物體內(nèi)有許多酶參與生化反應(yīng)，調(diào)節(jié)和控制著代謝的方向和速率。正常情況下，植物依賴體內(nèi)存在的活性氧清除系統(tǒng)，包括SOD、POD和CAT等維持自由基生成與消除的動態(tài)平衡，因此對活性氧清除的能力是決定細胞應(yīng)對脅迫抗性的關(guān)鍵因素。整個保護酶系統(tǒng)防御能力的強弱取決于這幾種酶相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。而植物體內(nèi)保護酶活性的強弱受到溫度變化的直接影響：凍害發(fā)生時，細胞中原生質(zhì)過度脫水，蛋白質(zhì)變性，酶活性下降或喪失，冰晶體還會對細胞造成物理性損傷，導(dǎo)致細胞死亡；日灼發(fā)生時，由于溫度過高導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性或凝固，酶失去活性，組織脫水灼傷甚至死亡，外在表現(xiàn)為樹干干燥開裂，葉片出現(xiàn)死斑。內(nèi)陸地區(qū)冬季樹干南側(cè)受日光直射，皮層內(nèi)溫度上升到20℃或更高，而北側(cè)皮層內(nèi)溫度與氣溫（0～5℃）大致相同，這種冷熱不均，使皮層與木質(zhì)部內(nèi)脹外縮，皮層開裂[1]。當日灼和凍害同時發(fā)生時，不僅會造成樹干、大枝樹皮組織損傷，骨干枝部位縱裂，影響水分和養(yǎng)分供給，還會使樹勢生長減弱，腐爛病、干腐病等病害蔓延，以至于死樹毀園，造成嚴重危害[2]。

庫爾勒香梨屬于新疆梨種（Pyrus sinkiangensis Yü），是新疆傳統(tǒng)地方品種。2002年巴州庫爾勒香梨種植面積達3.33×104hm2[3]，至2010年底達3.61×104hm2。經(jīng)過長期栽培馴化，使香梨具有較強的適應(yīng)性和抗逆性。然而，由于不利的氣候條件及近30年的氣候異常等，已嚴重影響庫爾勒香梨的正常生長發(fā)育，甚至因越冬傷害導(dǎo)致大量樹體死亡[4]。本文通過試驗測定越冬期間香梨樹干形成層保護酶活性變化特性，為后續(xù)的香梨越冬防護工作提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州庫爾勒市上戶鎮(zhèn)哈拉蘇村金友聯(lián)果品有限公司果園進行。該地區(qū)屬于暖溫帶大陸性干旱氣候（E 86°08'，N 41°45'），多年平均總?cè)照諘r數(shù)2990 h，年平均氣溫13.2℃，年極端最低氣溫-28℃，年極端最高氣溫38.2℃，1～3月逐日最低氣溫平均值-19℃，逐日最高氣溫平均值22℃；年降水量55 mm，年最大蒸發(fā)量為2788.2 mm，無霜期210 d，主風風向為東北風，海拔高度931.5 m。土壤母質(zhì)為山前沖積扇上緣，土壤類型為荒漠風沙土，1 m土層土壤質(zhì)地為沙礫至沙土[3-5]。試驗材料為庫爾勒香梨，試驗果園面積24 hm2（四圍也是梨園），梨樹株行距為4 m×5 m，株齡8年，樹干胸徑12～15 cm。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法

取樣時間為2009年1月22日、2月19日、3月21日。選取8棵（重復(fù)）直徑相仿、株齡8年且健康的梨樹，在離地50～60 cm高的樹干陰、陽面鑿取包括韌皮部、形成層2.5 cm寬，5 cm長的樹皮組織（不取木質(zhì)部）樣本并截取3～4個帶芽的當年生枝條，然后把樹皮組織樣本和枝條分別截至2 cm長，干凈紗布包裹，標記后放入液氮罐中，由于需測定數(shù)據(jù)較多，先將樣品轉(zhuǎn)移到實驗室后置于-30℃冰箱中保存，時間不超過24 h。

酶液提取：稱取鮮樣0.1～0.2 g于預(yù)冷的研缽中，加入2 mL預(yù)冷的提取介質(zhì)（50 mmol·L-1，pH 7.8的磷酸緩沖液，內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）研磨至勻漿，再加入提取介質(zhì)充分研磨沖洗，使終體積為5 mL，4℃下15000 g超速冷凍離心15 min，上清液即為酶提取液。

1.2.2 酶活性測定

SOD活性測定采用NBT（氮蘭四唑）顯色法[6]；POD活性測定采用李合生等方法[7]；CAT活性測定采用分光光度法，利用高錳酸鉀滴定法和紫外吸收法測定過氧化氫酶活性[8]。每個樣品測定5次。

1.2.3 樹干形成層溫度的測定

測量點取果園中心位置；相鄰兩行中選取健康的梨樹3棵（重復(fù)），在樹干陽、陰面離地面50～60 cm高處樹皮形成層與樹皮中間插入植物體內(nèi)熱電偶溫度傳感器（型號：AV-AT），采用AR5數(shù)據(jù)采集器采集連續(xù)3個月的溫度數(shù)據(jù)，詳細監(jiān)測方法參見文獻[9]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用DPS軟件對庫爾勒香梨不同部位形成層酶活性進行多重比較，用Excel統(tǒng)計酶活性與溫度的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 香梨取樣期間氣象條件及樹干形成層溫度變化

1～3月樹干形成層溫度變化與氣溫高低關(guān)系密切（見表1），當氣溫升高時，太陽輻射增強，樹干形成層溫度也隨之升高，反之亦然。隨著氣溫升高，形成層極端最低、最高溫度都有所升高。

表1 氣溫與樹干形成層溫度變化關(guān)系Table 1 Temperature change relationship between air and trunk cambium(℃)

1～3月陽面和陰面樹干形成層極端溫度有所差異（見表1）。陽面形成層極端最低溫度均低于陰面，極端最高溫度又均高于陰面。故陽面形成層溫度日溫差大于陰面，陽面日溫差最高值出現(xiàn)在2009年1月17日，達33.14℃，比陰面日溫差高17.14℃。冬季由于林木進入休眠期，抗凍性增強，但抗相對高溫能力下降。因此，日灼傷害在樹干陽面出現(xiàn)幾率比陰面大[9]。

樹干形成層溫度24 h變化：1月份日出前陰面形成層溫度略高于陽面，日出后陽陰面形成層溫度都呈現(xiàn)快速上升趨勢，陽面增幅高于陰面，14:00左右達到高峰值，隨后溫度持續(xù)下降，日落后陰面溫度降幅小于陽面，陽面溫度略低于陰面；2月份樹干陽陰面形成層溫度變化與1月份相似，峰值出現(xiàn)在15:00左右，溫差達15℃左右；3月份日出前陰面溫度略高，日出后陽陰面形成層溫度快速升高，陽面增幅較快，峰值出現(xiàn)在16:00左右，隨后溫度開始下降，陽面溫度降幅較大。

2.2 越冬期庫爾勒香梨樹SOD活性變化

由表2可知，同一個部位2月份酶活性均比其在1月份和3月份數(shù)據(jù)高，但各不同部位SOD酶活性差異不顯著。在持續(xù)低溫下，陽面酶活性較高，因為冬末春初期間，白天氣溫在0℃以上，夜間氣溫小于等于0℃，晝夜溫差常達10℃以上，樹皮向陽面受陽光直射，增溫快，溫差大，使形成層組織受損，細胞內(nèi)將產(chǎn)生過多的活性氧，迫使陽面形成層內(nèi)將產(chǎn)生大量SOD，清除細胞中的自由基，以免機體受到損害[10]。

表2 越冬期庫爾勒香梨樹干不同組織器官SOD活性變化Table 2 SOD activities variation in parts of Fragrant Pear trunk

超氧化物歧化酶活力變化趨勢為先升后降。因降溫初期梨樹在低溫條件下，體內(nèi)會產(chǎn)生過多的超氧物陰離子自由基，為維持體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài)，需要高活力的SOD酶來清除過多的自由基。但隨著溫度的降低，當溫度下降到超過各產(chǎn)量對寒冷的忍耐限度，自由基產(chǎn)生過多，細胞發(fā)生膜脂氧化作用，從而SOD活性一直降低[11]。樹體將遭到比較嚴重的凍害，高濃度的自由基超過傷害“閾值”，必將導(dǎo)致酶蛋白分子的破壞，從而降低超氧化物歧化酶活力，超氧化物歧化酶活性降低。

2.3 越冬期庫爾勒香梨樹POD活性變化

由表3可知，越冬期間庫爾勒香梨樹干形成層POD的活性變化與SOD活性變化的總體趨勢相似，即先上升后下降。

表3 越冬期庫爾勒香梨樹干不同組織器官POD活性變化Table 3 POD activities variation in parts of Fragrant Pear trunk

同一個部位2月份酶活性均比其在1月份和3月份數(shù)據(jù)高，庫爾勒香梨樹干陽面、陰面形成層的POD活性都存在顯著性差異；在1月份和2月份枝條和芽中的POD活性差異不顯著，而3月份枝條和芽的POD活性達顯著差異。低溫下，陽面和陰面形成層的POD活性較高，芽的活性最低，陽面POD活性約是芽中的兩倍，即老化組織中POD活性較高，幼嫩組織POD活性較低。這是因為POD能使組織中的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度[12]，所以POD可作為判斷組織老化的一種生理指標。

2.4 越冬期庫爾勒香梨樹CAT活性變化

由表4可知，同一個部位2份月CAT活性均比其在1月份和3月份活性高，樹干陽面、陰面形成層的CAT活性存在顯著差異；枝條、芽在1月份和3月份存在顯著差異，在2月份差異不顯著；持續(xù)低溫下，陽面CAT活性較高。CAT催化H2O2分解為H2O和O2，可清除植物體內(nèi)的氧自由基，防止氧自由基對植物組織的傷害。

表4 越冬期庫爾勒香梨樹干不同組織器官CAT活性變化Table 4 CAT activities variation in parts of Fragrant Pear trunk

庫爾勒香梨樹干形成層CAT活性變化比較平緩，隨著溫度降低，其活性升高；隨著溫度升高，CAT活性表現(xiàn)為下降，表明CAT活性與組織中H2O2含量和植物的抗逆性密切相關(guān)。

3 討論

在逆境脅迫下，細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，給細胞帶來一定傷害。SOD是植物體內(nèi)清除活性氧的保護酶之一，超氧自由基是生物細胞某些生理生化反應(yīng)常見的中間產(chǎn)物，是活性氧的一種[13]。SOD能通過歧化反應(yīng)清除生物細胞中的超氧自由基，生成H2O2和O2-，H2O2由CAT催化生成H2O和O2，從而減少自由基對有機體的毒害。SOD活性高低以及在逆境中其活性變化趨勢在一定程度上可反映植物抗逆性的強弱。POD具有雙重作用：一方面POD可在衰老或逆境的初期表達，清除H2O2，表現(xiàn)為保護效應(yīng)，作為細胞活性氧保護酶系統(tǒng)成員之一；另一方面POD可在衰老或逆境的后期表達，作為衰老組織中不斷累積活性氧的來源之一[14]。本試驗主要體現(xiàn)POD的清除作用。植物在逆境下或衰老時，由于體內(nèi)活性氧代謝加強而使H2O2發(fā)生累積。CAT可以催化H2O2分解成H2O和O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成有害的羥自由基。

綜上所述，庫爾勒香梨植株的保護酶活性強弱與活性氧的積累量、樹木受損傷程度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。保護酶在面對低溫脅迫時表現(xiàn)出一定的活躍性來維持植物正常的生理功能。酶活性的最高值之所以沒有出現(xiàn)在平均氣溫最低的1月份，而是出現(xiàn)在平均氣溫相對較低的2月份，是因為2月份處于冬季末端，冷熱交替明顯，晝夜溫差極大，氣溫不穩(wěn)定，凍融結(jié)合使樹體受損更為嚴重，日灼和凍害同時對香梨造成的傷害程度為冬季中最大，導(dǎo)致香梨體內(nèi)活性氧較1月份增多，從而引起保護酶活性增強。這一現(xiàn)象與2月份形成層平均日較差為3個月份中最大相吻合。進入3月份，溫度上升，低溫脅迫減弱，日灼和凍害同時發(fā)生作用的效果降低，活性氧含量減小，保護酶活性下降。冬季特別是冬末春初期間的冷熱變化、凍融交替和溫度驟變，使枝干（尤其是樹干）組織損傷，出現(xiàn)皮層局部死亡，甚至形成層和木質(zhì)部外層也死亡[1]。因此著重在2月份加強樹木的防護工作，防止日灼與凍害同時作用帶給樹木的傷害。

冬季日灼現(xiàn)象的存在是導(dǎo)致形成層溫度劇烈變化，保護酶活性變化的重要原因。庫爾勒香梨樹干陽面形成層溫度變化比陰面強烈，這與冬季香梨直接受陽光暴曬而升溫有關(guān)；越冬期間樹干陽面日灼傷害并不只是細胞間持續(xù)結(jié)冰導(dǎo)致的，是強光使樹干陽面組織反復(fù)升溫降溫，組織抗寒性降低所致[8]。從保護酶活性的變化特征分析得知，冬季既有低溫脅迫，還有不為人們所熟知的日灼傷害。

4 結(jié)論

a.保護酶活性隨著形成層溫度的降低而升高，但同時受日灼影響。保護酶活性的變化反映出香梨樹木受損害的程度。越冬期間，凍害和日灼共同作用造成對樹木的傷害，其中2月份受日灼和凍害共同作用最為嚴重，因此有必要在此期間采取遮蔭等措施防止日灼，從而減輕日灼和凍害同時對樹干的傷害。

b.庫爾勒香梨樹干形成層陽陰面的SOD活性差異不顯著，而POD、CAT活性達差異極顯著，因此POD和CAT可作為樹干日灼傷害的指標。由于越冬期間香梨樹干無葉片遮蔭，太陽輻射直接暴曬樹干陽面，使陽面形成層溫度日變化比陰面劇烈，形成層中活性氧增多，促使保護酶活性變化增強，陽面受日灼和凍害同時作用的可能性遠大于陰面。

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