范瑛閣，方海晶，李 莎

（1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；3.霍城縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，新疆 庫(kù)爾勒 835200）

黃瓜白粉病由葫蘆科白粉菌Erysiphe cucurbitacearum Zheng et chen或單絲殼白粉菌Sphaerotheca fuligenea（Schlecht）Poll引起[1]，其病原物在黃瓜整個(gè)生育期均可侵染。近年來(lái)隨著保護(hù)地栽培的發(fā)展，白粉病的危害愈加嚴(yán)重[2-3]。目前，生產(chǎn)上防治主要采用化學(xué)藥劑，但化學(xué)農(nóng)藥引起新的病蟲(chóng)害大發(fā)生、污染農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境等問(wèn)題已成為國(guó)際上研究的焦點(diǎn)。隨著環(huán)境法規(guī)制定普及和公眾環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，蔬菜生產(chǎn)應(yīng)少含或不含化學(xué)殘留物，特別對(duì)于新疆沙漠化半干旱、半鹽堿化的脆弱生態(tài)環(huán)境，生態(tài)平衡恢復(fù)能力、環(huán)境污染修復(fù)能力相對(duì)較弱地區(qū)，更應(yīng)減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，以減少生態(tài)環(huán)境壓力保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[4]。利用微生物防治黃瓜白粉病的研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道。陳麗等報(bào)道放線菌S-930-6精提物800 mg·L-1對(duì)西葫蘆白粉病的保護(hù)和治療作用分別為91%和97%[5]；Romero等研究三種微生物對(duì)黃瓜白粉病的防效進(jìn)行測(cè)定，三種微生物包括基于白粉寄生孢（Ampelomyces quisqualis）的AQ10、基于蠟蚧輪枝菌（Lecanicillium lecanii）的生物產(chǎn)品Mycotal和枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis），結(jié)果表明枯草芽胞桿菌對(duì)瓜類白粉病的效果接近于兩種重寄生菌和醚菊酯農(nóng)藥對(duì)照[6]。在生防機(jī)理方面，也有關(guān)于防御酶系、促生作用和拮抗作用的報(bào)道[7-10]。生防細(xì)菌H1、H2和H3從黃瓜根際分離，對(duì)黃瓜白粉病防效顯著[11]。生防細(xì)菌對(duì)植物病害的生防機(jī)理通常有抗生作用、溶菌作用、重寄生作用、誘導(dǎo)抗性、競(jìng)爭(zhēng)作用等，而抗生作用主要表現(xiàn)為有益微生物的拮抗作用[12-13]。本研究通過(guò)掃描電鏡直接觀察的方法，從拮抗機(jī)理、重寄生現(xiàn)象和溶菌作用方面，揭示生防菌對(duì)黃瓜白粉菌的作用位點(diǎn)和作用機(jī)理。白粉菌為專性寄生菌，不能采用對(duì)峙培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法進(jìn)行測(cè)定，針對(duì)這一問(wèn)題，結(jié)合前人研究的基礎(chǔ)[14-15]，本研究利用掃描電鏡的方法探索三株生防細(xì)菌對(duì)白粉病菌的作用位點(diǎn)以及白粉菌的超微結(jié)構(gòu)變化，探討其抗病機(jī)理，為我國(guó)主要植物病害有效防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試黃瓜品種為白粉菌易感品種長(zhǎng)春密刺。供試生防菌H1、H2、H3由新疆地區(qū)蔬菜根際分離得到。

1.2 方法

1.2.1 田間小區(qū)劃分

在塔里木大學(xué)試驗(yàn)田選取靠近水源地塊，劃分四個(gè)小區(qū)，春灌、深翻、平整、起壟。2011年4月28日，黃瓜種子保濕催芽48 h后種植，5月28日間苗，每小區(qū)定苗50棵并搭架。

1.2.2 拮抗作用前期處理

①待黃瓜開(kāi)花期，接種白粉菌，見(jiàn)葉片上有稀疏白粉菌斑后開(kāi)始培養(yǎng)生防菌。②生防菌H1、H2、H3用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，配制成108cfu·mL-1的菌懸液，用噴壺均勻噴施于黃瓜葉片表面，田間培養(yǎng)12、24、36、48 h后隨機(jī)取葉片備用，3次重復(fù)，以噴施清水為對(duì)照。

1.2.3 電鏡觀察樣品制備

①取處理后的黃瓜葉片，剪取有白粉病斑處5 cm大小，戊二醛過(guò)夜固定；②磷酸緩沖液浸泡2次，每次15 min；然后在10%、20%、30%、50%、70%、90%梯度酒精浸泡，每次15 min；最后100%酒精浸泡2次，每次20 min；③叔丁醇沖洗2次，最后1次放4℃冰箱固化；④K750X冷凍干燥機(jī)冷凍干燥；⑤ETD-2000小型離子濺射儀鍍金；⑥SUPRA 55VP ZEISS掃描電鏡觀察，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗作用的觀察

如圖版Ⅰ-A所示，清水處理的菌絲粗壯、完整、表面光滑。經(jīng)H1處理12 h后的白粉菌絲完整、表面光滑，菌絲表面少量的細(xì)菌菌體附著（見(jiàn)圖版Ⅰ-B）；H1處理24 h后的菌絲完整、可見(jiàn)大量生防菌體附著表面，說(shuō)明生防菌H1可以在細(xì)菌菌絲上定植，并且大量繁殖（見(jiàn)圖版Ⅰ-C）；處理36 h后，可見(jiàn)有菌絲體斷裂，并且斷裂處常有大量生防菌體定植（見(jiàn)圖版Ⅰ-D）；48 h后菌絲斷裂、扭曲、變形嚴(yán)重，在菌絲扭曲變形處滋生大量H1菌體，其原因可能是H1產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)對(duì)菌絲的拮抗作用（見(jiàn)圖版Ⅰ-E）。經(jīng)H2處理12 h后的白粉菌絲粗壯、完整，菌絲表面發(fā)現(xiàn)有少量H2菌體（見(jiàn)圖版Ⅰ-F）；24 h后，發(fā)現(xiàn)菌絲表面H2菌體數(shù)量增多，并且有成堆聚生的現(xiàn)象，可能是由于H2在白粉菌絲表面大量繁殖造成的，并發(fā)現(xiàn)白粉菌絲有變形，凹陷現(xiàn)象（見(jiàn)圖版Ⅰ-G）；36 h后，菌絲變形、扭曲加劇，在H1聚集處多發(fā)現(xiàn)白粉菌菌絲斷裂現(xiàn)象，可能是由于H2產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)刺激所致（見(jiàn)圖版Ⅰ-H）；48 h后，白粉菌絲破裂嚴(yán)重，圖版Ⅰ-I中所示為白粉菌絲破裂處聚集大量H2菌體。經(jīng)H3處理12 h后，白粉菌絲表面可見(jiàn)少量H3菌體（見(jiàn)圖版Ⅰ-J），處理24 h后，白粉菌絲表面H3菌體增多（見(jiàn)圖版Ⅰ-K）；處理36 h后，白粉菌絲扭曲、變形，菌絲表面生防菌體大量繁殖（見(jiàn)圖版Ⅰ-L）；處理48 h后，H3菌體在菌絲上大量繁殖，白粉菌絲扭曲變形，向內(nèi)凹陷（見(jiàn)圖版Ⅰ-M）。

圖版Ⅰ H1、H2和H3三種生防菌對(duì)黃瓜白粉菌生長(zhǎng)狀態(tài)的影響PlateⅠ Effect of bio-control bacteria H1,H2 and H3 on the growth of cucumber powdery mildew

2.2 溶菌作用的觀察

生防菌H1、H2、H3對(duì)黃瓜白粉菌溶菌作用的測(cè)定如圖版Ⅰ所示。圖版中的D和E圖為H1處理36和48 h后的白粉菌絲，兩圖中均發(fā)現(xiàn)有菌絲破裂、溶解現(xiàn)象，并在溶解處多有H1菌體聚生，說(shuō)明H1具有溶菌作用；圖版中的H圖和I圖為H2處理36和48 h后的白粉菌菌絲，僅發(fā)現(xiàn)在H2菌體定植處白粉菌菌絲有斷裂現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)菌絲的溶解，說(shuō)明H2對(duì)黃瓜白粉菌絲無(wú)溶解作用；圖版中的L圖和M圖為H3處理36和48 h后的白粉菌菌絲，從圖中可見(jiàn)白粉菌絲雖有變形、扭曲，但沒(méi)有破裂、溶解現(xiàn)象，說(shuō)明H3對(duì)黃瓜白粉菌絲也不具有溶菌作用。

2.3 重寄生作用的觀察

生防菌H1、H2、H3對(duì)黃瓜白粉重寄生作用的測(cè)定如圖版Ⅰ所示。生防菌H1、H2和H3處理后的菌絲表面均發(fā)現(xiàn)有菌體大量繁殖現(xiàn)象，但只能證明生防菌在白粉菌菌絲表面繁殖，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌體的作用位點(diǎn)。

3 討論與結(jié)論

黃瓜白粉菌為專性寄生菌，不能在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此，對(duì)峙培養(yǎng)觀察拮抗作用的方法不適于黃瓜白粉菌的研究。本研究根據(jù)Fakhouri和馬青研究結(jié)果[14-15]，利用掃描電鏡直接觀察方法來(lái)探討生防菌對(duì)黃瓜白粉菌的作用機(jī)理。通過(guò)不同時(shí)期的觀察證實(shí)，生防菌H1對(duì)白粉菌具有拮抗和溶菌作用，無(wú)重寄生作用；生防菌H2和H3對(duì)黃瓜白粉菌均具有拮抗作用，無(wú)溶菌和重寄生作用。

研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，利用掃描電鏡觀察專性寄生菌的拮抗作用、溶菌作用和重寄生作用是可行的，但要觀察白粉菌絲內(nèi)部細(xì)胞生理變化，需要借助投射電鏡的超薄切片觀察。

Romero等利用掃描和投射電鏡觀察到，枯草芽胞桿菌對(duì)黃瓜白粉病的拮抗作用表現(xiàn)為對(duì)白粉菌細(xì)胞的破壞而阻止孢子萌發(fā)，枯草芽胞桿菌對(duì)瓜類白粉病的拮抗作用關(guān)鍵因素是生防菌能夠定植于黃瓜葉面[6]。

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