苑志明，勞杉杉，秦智偉，周秀艷

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

維生素C別名抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA），是藻類、高等植物和大多數(shù)動物體內(nèi)合成的一種己糖內(nèi)酯化合物?？箟难峥梢郧宄矬w內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧（Reactive oxidative species，ROS），一定濃度的ROS是生物體內(nèi)必須的，但ROS濃度過高會造成細胞損傷，引起生物衰老和死亡，逆境會造成植物體內(nèi)ROS升高[1]。高等植物抗壞血酸合成的L-半乳糖途徑中，L-半乳糖-1，4內(nèi)酯由GalLDH直接氧化成抗壞血酸，GalLDH是抗壞血酸合成過程中的關(guān)鍵酶之一[2]。

由于人體內(nèi)缺乏抗壞血酸合成過程中的關(guān)鍵酶，只能從食物中攝取[3]。因此，園藝產(chǎn)品中的AsA含量已成為衡量品質(zhì)的重要指標(biāo)。黃瓜中抗壞血酸含量較低，到目前為止沒有研究能解釋這種現(xiàn)象。本試驗通過克隆黃瓜中抗壞血酸合成的關(guān)鍵酶GalLDH，為今后研究黃瓜中抗壞血酸含量較低的原因，改良黃瓜的營養(yǎng)品質(zhì)奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為黃瓜D08108果肉，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。雌花自然開花后10 d采樣，將果肉切成薄片用錫紙包好，并用液氮速凍后存于-80℃冰箱，用于提取RNA。將幼嫩的番茄（HN11）葉片稱取0.2 g用錫紙包好，并用液氮速凍后存于-80℃冰箱，用于提取DNA。番茄品種由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。

載體pBI121和農(nóng)桿菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實驗室提供。黃瓜組織培養(yǎng)外植體選用栽培品種649，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。

1.2 應(yīng)用RT-PCR克隆黃瓜GalLDH

1.2.1 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄

稱取0.5 g果肉用Trizol法提取RNA，用SMA3000分光光度計檢測，用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，取2 μL RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，取3 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA質(zhì)量。

1.2.2 RT-PCR

根據(jù)GenBank中登錄的甜瓜GalLDH（AF252339.2）的基因序列設(shè)計引物，SGalLDH：5'GTTGGGG AATCATAAACC 3'和AGalLDH：5'AAACACTTATC CAACTGGACAAC 3'。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用SGalLDH和AGalLDH進行PCR，反應(yīng)條件為：94℃5 min預(yù)變性后，94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收與測序

將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，百泰克多功能小量DNA回收試劑盒進行膠回收，連接到pEASY-T3載體（全式金）上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中，并涂在含有50 mg·mL-1Amp+、IPTG和X-gal的LB平板上，挑選白色菌落，放入含有Amp+的5 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃條件下，200 r·min-1，過夜。百泰克質(zhì)粒小量回收試劑盒提取質(zhì)粒，F(xiàn)ermentas快速內(nèi)切酶Eco RⅠ37℃酶切5 min，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段。由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成測序。

1.3 2A12果實特異性啟動子的克隆

CTAB法提取番茄幼嫩葉片DNA，擴增2A12基因的引物序列為S2A12：5'AGCACTTGTTAGA CTCATCTG 3'和 A2A12：5'AATGGTTTTGGATTA ATTGC 3'，以番茄DNA為模板進行PCR擴增。

1.4 酶切位點的添加

在S2A12添加HindⅢ位點即M-S2A12：5'GT CAAGCTTAGCACTTGTTAGACTCATCT 3'，在A2A12上添加XbaⅠ位點即M-A2A12：5'GTATCTAGAAA TGGTTTTGGATTAATTGC 3'。在SGalLDH上添加XbaⅠ位點即M-SGalLDH:5'GTCTCTAGAGTTGGG GAATCATAAACC 3'，在AGalLDH上添加SmaⅠ位點即M-AGalLDH:5'GATCCCGGG AAACACTTATC CAACTGGACAAC 3'。

1.5 表達載體的構(gòu)建和檢測

對含有GalLDH目的片段（已添加酶切位點）的pEASY-T3載體和pBI121分別用Fermentas快速內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ進行雙酶切，進行膠回收，然后用Fermentas T4連接酶進行連接；將連接好的中間載體和含有2A12基因（已添加酶切位點）的pEASY-T3載體分別用Fermentas快速內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切，進行膠回收，然后用Fermentas T4連接酶進行連接，將連接好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。用CTAB法提取黃瓜總DNA。

1.6 黃瓜GalLDH的cDNA生物學(xué)分析

采用Primer premier 5.0軟件進行引物設(shè)計，由ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析開放閱讀框；采用ExPASy的ProtParam Tool（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）分析編碼氨基酸理化性質(zhì)；應(yīng)用TreeView和CLUSTALX進行序列比對和進化樹構(gòu)建分析。

2 結(jié)果與分析

2.1RNA的質(zhì)量、黃瓜GalLDH的RT-PCR擴增

提取黃瓜D08108果肉的總RNA，用SMA3000分光光度計檢測，OD260/280≈1.8，3015 ng·μL-1，取3 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量見圖1（A），以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行RT-PCR擴增，獲得一條1880 bp的特異性條帶見圖1（B）。

圖1 黃瓜果實總RNA（A）及GalLDH基因的RT-PCR擴增（B）Fig.1 Total RNA(A)and RT-PCR product of GalLDH(B)from fruit of cucumber cultivar D08108

2.2 黃瓜GalLDH的生物學(xué)分析

黃瓜GalLDH經(jīng)測序是一個全長為1880 bp cDNA序列，包含一個長為1773 bp的完整開放閱讀框，在5'端有47 bp的非編碼序列，在3'端有60 bp的非編碼序列。其GenBank登錄號：HQ446099，堿基序列及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖2所示，通過與GenBank中登錄的同源基因進行核苷酸相似度比較，黃瓜GalLDH與甜瓜相似度最高，為96%，與獼猴桃相似度為76%，與其他物種相似度均在70%以上。

圖2 植物GalLDH基因氨基酸序列系統(tǒng)樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of plant GalLDH gene

黃瓜GalLDH氨基酸序列的分子質(zhì)量為67297.2，理論等電點9.04，氨基酸數(shù)590，親水性平均值-0.475，不穩(wěn)定指數(shù)48.30，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 表達載體構(gòu)建的檢測

對構(gòu)建好的載體進行用SGalLDH：5'GTTGGG GAATCATAAACC 3'和 AGalLDH：5'AAACACTTAT CCAACTGGACAAC 3'、S2A12：5'AGCACTTGTTA GACTCATCTG 3'和A2A12：5'AATGGTTTTGGATT AATTGC 3'進行PCR檢測，得到一條1880 bp的目的條帶和一條850 bp的目的條帶（見圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.3 Detection of recombinant plasmid by PCR

2.4 轉(zhuǎn)基因黃瓜的檢測

選用2A12啟動子的特異引物對轉(zhuǎn)基因黃瓜進行檢測，共得到13株再生植株，其中轉(zhuǎn)基因植株5株。轉(zhuǎn)基因陽性植株擴增條帶與預(yù)期一致，陰性植株沒有擴增出條帶，第1道是構(gòu)建載體，第2道是陰性對照，3～7道是擴增出的陽性條帶（見圖4）。組培圖片中A是子葉節(jié)，B是組培苗，C是組培苗的生根過程，D是馴化中的組培苗（見圖5）。

圖4 轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的PCR檢測Fig.4 Detection of transgenic Cucumis sativus by PCR

圖5 黃瓜組培Fig.5 Cucumber tissue culture

3 討論與結(jié)論

抗壞血酸含量的高低是衡量園藝產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[4]，抗壞血酸在光合作用和光合保護中起重要作用[5-6]。抗壞血酸還可以作為一系列重要酶反應(yīng)的輔因子[3]，抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的相對比率影響植物的細胞分裂[7]。高等植物抗壞血酸的合成主要是通過L-半乳糖途徑，但是也不排除其他途徑的可能[8]。本試驗中克隆的GalLDH在高等植物中普遍存在。目前造成黃瓜抗壞血酸含量低的原因并不明確，因為抗壞血酸參與植物體內(nèi)大量的代謝活動，一直處在一個動態(tài)平衡的條件下。因此通過黃瓜GalLDH的克隆，為黃瓜中抗壞血酸含量的研究奠定基礎(chǔ)，為今后黃瓜抗壞血酸的研究起到輔助作用。不足之處，由于試驗使用的是果實特異啟動子，組培苗并未結(jié)瓜，所以無法檢測其抗壞血酸的含量變化。

[1] Agius F,Lamothe R G,Caballero J L V.Engineering increased vitamin C levels in plants by over expression of a D-galacturonic acid reductase[J].Nature Biotechlonogy,2003,21:177-181.

[2] Dvaey M D,Van Montaug M,Inze D,et al.Plnat L-ascorbic aeid:chemistry,function,metabolism,bioavailability,and effects of processing[J].J Sci Food Agr,2000,80:825-860.

[3] 趙麗華,裘娟萍,黃敏,等.抗壞血酸糖類衍生物的研究進展[J].飼料工業(yè),2002,25(2):28-30.

[4] Eskling M,Avridsson P O,Akerlund H E.The xanthophylls cycle,its regulation and components[J].Physiol Palnt,1997,100:806-816.

[5] Potters G,Nele H,Roland J C.Asorbate and dehydroaseorbate influence cell cycle progression in a tobacco cell suspension[J].Plant Physiol,2000,11(24):17-20.

[6] 曲麗,秦智偉.黃瓜白粉病病原菌及抗病性研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,38(6):835-841.

[7] 石延霞,李寶聚,劉學(xué)敏.黃瓜霜霉病研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,33(4):391-395.

[8] Wheeler G L,Jones M A,Smimoff N.The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants[J].Nature,1998,393:365-369.

[9] Wnag W,Vinocur B,Altmna A.Plant responses to doruhgt,salniity and extreme temperatures:Towards genetic cngineering for stress tolerance[J].Planta,2003,218:1-14.

[10] Yabuta Y,Motoki T,Yoshimura K.Thylakoid membrane-bound ascorbate peroxidase is a limiting factor of antioxidative systems under photo-oxidative stress[J].Plant J,2002,32:915-925.

[11] 張鵬,秦智偉.黃瓜耐熱性遺傳分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,38(4):486-490.