吳衛(wèi)東，荊西民，岳靜靜

脂聯(lián)素受體（adiponectin receptor，AdipoR）分為兩種，脂聯(lián)素受體1（AdipoR1）和脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）?，F(xiàn)有的研究證實，在動脈內(nèi)皮細胞中兩種AdipoR都有表達，且動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與血管組織AdipoR1表達下調(diào)相關(guān)，有學(xué)者稱這種現(xiàn)象為脂聯(lián)素抵抗［10］。動物實驗表明［1，2］，有氧運動能有效地延緩和抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，是防治動脈粥樣硬化的重要手段。運動能否通過增加主動脈AdipoR1蛋白的表達，進而提高脂聯(lián)素的作用效率達到防治動脈粥樣硬化的作用，相關(guān)研究鮮見報道。本研究以ApoE基因缺陷小鼠為動物模型，通過觀察運動對主動脈AdipoR1蛋白表達的影響，探討運動防治動脈粥樣硬化的另一可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡雄性ApoE基因缺陷小鼠20只，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部，適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機分為安靜組（C組，10只）和運動組（E組，10只）。兩組均以二級條件飼養(yǎng)，飼以高脂膳食飼料（含21％脂肪，0.15％膽固醇，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部）。

1.2 運動方案

E組小鼠每日上午9：00～10：00進行跑臺運動，遞增運動強度和時間，每周5次，共14周。小鼠運動強度、遞增運動強度、運動時間參考Fernando［6］等的研究確定。前6周由10 m/min×30 min逐漸遞增至13 m/min×60 min，后8周開始穩(wěn)定在13 m/min×60 min，跑臺坡度為0°。

1.3 取材與指標檢測

第14周末，所有小鼠處死取血，4℃3 000 rpm離心10 min，制備血清，用DEPC水進行心臟血管在體灌流，然后取出主動脈，取腎周和附睪脂肪墊放入DEPC水中沖洗表層血液，并用濾紙吸干。取材前E組小鼠停止運動48 h，禁食過夜。

主動脈病理形態(tài)觀察：標本經(jīng)4％多聚甲醛固定4 h后，OCT包埋，進行冰凍切片，切片厚度10μm，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察血管彈力纖維板的斷裂情況。

血清脂聯(lián)素含量測定：采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫（ABCELISA）方法，試劑盒購自美國R＆D公司。

脂肪組織脂聯(lián)素m RNA測定：RT－PCR法檢測。采用Trizol一步法提取總RNA，采用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，進行30個循環(huán)次數(shù)的PCR。引物序列檢索自NCBI－Nucleotide數(shù)據(jù)庫，脂聯(lián)素引物擴增產(chǎn)物長度196 bp，上游引物：5’－AATCATTATGACGGCAGCAC－3’，下游引物：5’－CCAGATGGAGGAGCACAGAG－3’；Beta－Actin擴增產(chǎn)物長度511 bp，上游引物5’－CCATCTACGAGGGCTATGCT－3’，下游引物5’－CAAGAAGGAAGGCTGGAAAA－3’。

主動脈AdipoR1蛋白測定：Western免疫印跡檢測。將主動脈勻漿后離心（16 000 rpm，30 min）取上清，標定蛋白濃度上樣后，經(jīng)12％的SDS－PAGE電泳分離。將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5％的脫脂奶粉封閉，TBST沖洗后加兔抗鼠AdipoR1一抗4℃過夜。TBST液沖洗，加堿性磷酸酶標記的二抗孵育，NBT/BCIP顯色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.5數(shù)據(jù)軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差±SD）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 主動脈血管壁HE染色觀察結(jié)果

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，C組小鼠主動脈血管壁纖維板分裂成多層狀，出現(xiàn)間隙，斷裂嚴重，內(nèi)膜失去原有的波浪狀，E組小鼠主動脈血管壁彈力纖維排列致密，偶有斷層，內(nèi)膜較完整（圖1）。

圖1 兩組小鼠主動脈竇橫截面HE染色觀察圖（LM×200，a為C組，b為E組）

2.2 脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達及其血清水平

表1顯示，14周實驗后E組小鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達顯著高于C組（P＜0.05），其血清脂聯(lián)素水平同樣顯著高于C組（P＜0.01）。

表1 本研究兩組小鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達及血清脂聯(lián)素含量比較一覽表

圖2 脂聯(lián)素mRNA表達水平示意圖（M：標準DNA；E：運動組；C：安靜組）

2.3 主動脈AdipoR1蛋白表達水平

表2顯示，E組小鼠經(jīng)過14周有氧運動后主動脈AdipoR1蛋白表達顯著高于C組（P＜0.05）。

表2 本研究兩組小鼠主動脈AdipoR1蛋白表達比較一覽表

圖3 Western Blot檢測AdipoR1蛋白的表達圖（E：運動組；C：安靜組）

3 討論

3.1 有氧運動通過脂聯(lián)素及其受體1發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用的可能機制

從主動脈冰凍切片的結(jié)果來看，C組小鼠主動脈血管壁纖維板分裂成多層狀，出現(xiàn)間隙，斷裂嚴重，內(nèi)膜失去原有的波浪狀。在C組小鼠主動脈血管壁纖維彈力板斷裂、內(nèi)膜完整性破壞后，主要位于動脈中層的通過彈力板與內(nèi)膜隔開的平滑肌細胞會從中膜遷移到內(nèi)膜。結(jié)果會使遷移至內(nèi)膜的平滑肌細胞聚集在由壞死的泡沫細胞組成的脂池周圍，由收縮型演變?yōu)楹铣尚停a(chǎn)生膠原纖維和彈力纖維組成纖維帽包繞脂池形成典型的動脈粥樣硬化斑塊。隨著病變的發(fā)展，血管會首先出現(xiàn)外向型重塑，主要表現(xiàn)為血管壁增厚并向外擴大而管腔并不狹窄。如果動脈粥樣硬化斑塊繼續(xù)生長超過橫截面積的40％，則開始出現(xiàn)負向重塑，血管腔出現(xiàn)狹窄［3］。實驗結(jié)果顯示，E組小鼠主動脈血管壁纖維彈力板和內(nèi)膜相對C組較完好，提示，有氧運動有效延緩了動脈粥樣硬化的發(fā)展。

脂聯(lián)素是脂肪組織合成分泌的細胞因子，且有隨內(nèi)臟脂肪組織減少，基因表達水平升高的趨勢，Stefan等［11］的研究證實，其在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。臨床資料顯示，脂聯(lián)素與動脈粥樣硬化發(fā)病的許多環(huán)節(jié)密切相關(guān)［7］，在健康人血液中含量豐富，但在動脈粥樣硬化患者血液中的濃度卻顯著降低。本研究結(jié)果顯示，E組小鼠經(jīng)過14周有氧運動的訓(xùn)練后，脂聯(lián)素的基因表達和血清水平都有顯著提高，提示，E組小鼠動脈粥樣硬化病變的發(fā)展要慢于C組小鼠。

脂聯(lián)素要發(fā)揮作用必須通過受體的介導(dǎo)才能實現(xiàn)，動脈粥樣硬化血管AdipoR顯著下降，可能是導(dǎo)致血管損傷的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，E組小鼠AdipoR1蛋白表達明顯增加，動脈病變較C組明顯改善，內(nèi)膜完整性較好。分析其機制可能有：第一，運動干預(yù)同時上調(diào)了血清脂聯(lián)素和AdipoR1蛋白表達，脂聯(lián)素與AdipoR1結(jié)合效率提高，直接作用于血管的病變部位，抑制主動脈內(nèi)皮細胞表面表達的血管粘附分子（VCAM）－1、E－選擇素及細胞間粘附分子（ICAM）－1等，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用［9］；第二，脂聯(lián)素與AdipoR1結(jié)合可激活A(yù)MP活化蛋白激酶（AMPK），抑制糖異生相關(guān)因子的表達，增加乙酰輔酶A羧化酶的磷酸化，增強脂肪酸的氧化和葡萄糖的攝取，還可以通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα），增強脂肪酸的氧化，降低甘油三酯（TG）的濃度，有效延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展［8］。

3.2 有氧運動對AdipoR1蛋白表達影響的可能機制

本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動可以使主動脈AdipoR1蛋白表達顯著增加，分析其可能機制有：1）胰島素對Adipo R1的負性調(diào)節(jié)作用。Christiansen T［5］的研究發(fā)現(xiàn)，降低血液中胰島素的水平可以使AdipoR1表達顯著增加，反之，注射胰島素可顯著抑制其表達。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過14周的有氧運動，AdipoR1蛋白表達顯著增加，這可能是有氧，的攝取和減少肝糖的異生，同時，血液中胰島素水平降低，使Adipo R1的表達處于脫抑制的狀態(tài)。2）過氧化物增殖活化受體γ（PPARγ）的調(diào)控。Chinetti等人［4］研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞上的Adipo R受到PPARγ調(diào)控，PPARγ增加可以顯著增強AdipoR的表達。有氧運動可以通過激活PPARγ的表達改善由肥胖引起的胰島素抵抗，提高AdipoR1蛋白的表達。

4 小結(jié)

本研究表明，運動可以提高血清脂聯(lián)素水平、脂聯(lián)素mRNA及AdipoR1蛋白表達，從而抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的作用，這可能是運動抗動脈粥樣硬化作用的另一機制。

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