李俊華,王正珍,王軍力,唐云峰
挫傷和拉傷是運(yùn)動醫(yī)學(xué)臨床上常見的骨骼肌損傷。挫傷后所引起的肌肉組織的血腫機(jī)化、瘢痕修復(fù)不僅影響運(yùn)動員的運(yùn)動能力,且對運(yùn)動壽命構(gòu)成了潛在威脅,是造成全球運(yùn)動員困擾的難題之一[6]。
斜刺阿是穴治療骨骼肌損傷,具有療效高、見效快、療程短、療效持久穩(wěn)定、費(fèi)用低、操作簡便等顯著優(yōu)點(diǎn)。它不僅適用于運(yùn)動引起的骨骼肌損傷,也適用于體力勞動和日常生活所引起的骨骼肌損傷,并對各年齡段患者的急性和慢性損傷都有很高的療效。阿是穴斜刺能夠迅速加強(qiáng)肌肉收縮蛋白的組裝合成,使收縮結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)正常、疼痛消失,因而療效持久、穩(wěn)定。本研究采用針刺治療骨骼肌損傷,用自然愈合作為對照,比較并觀察骨骼肌鈍挫傷后針刺對骨骼肌損傷修復(fù)過程中肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響,探討針刺對骨骼肌損傷修復(fù)的作用機(jī)理。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
雄性SD大鼠,8周齡,體重220~250g,級別:SPF,購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。
1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
1.蘇州針灸用品有限公司生產(chǎn)的環(huán)球牌一次性無菌針灸針:0.25×40 mm,XSZ-H光學(xué)顯微鏡。
2.ERMAINC切片機(jī);KD-BM生物組織包埋機(jī);MIAS醫(yī)學(xué)頭像分析管理系統(tǒng)。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑
小鼠抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原(PCNA),即用型SABC試劑盒,一抗稀釋液,DAB顯色試劑盒,均購自武漢博士德生物工程有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌鈍挫傷模型的建立
大鼠購進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)2天,參照Kami等[18]的方法,制作本次實(shí)驗(yàn)的大鼠骨骼肌鈍挫傷模型:即2%戊巴比妥鈉,按0.25 ml/100 g[7]劑量進(jìn)行腹腔注射,大鼠麻醉后俯臥位固定四肢,伸膝、踝背屈90°,用自制打擊裝置從15 cm高處自由垂直落下打擊大鼠右小腿內(nèi)側(cè)面(其皮下為腓腸肌中段),打擊面直徑1.0 cm,下落物體長20 cm,重500 g,重力7.96 N,動能2.54 J。經(jīng)解剖證實(shí)大鼠腓腸肌鈍挫傷成功率100%。損傷程度相當(dāng)于人體中度挫傷。
1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和治療方案
將60只大鼠隨機(jī)分為正常組6只,造模后隨機(jī)分為即刻組6只、自然愈合組24只和針刺治療組24只。自然愈合組(對照組)和針刺治療組(實(shí)驗(yàn)組)又根據(jù)取材時間進(jìn)一步分為損傷后第1天、第2天、第4天和第6天組。針刺治療組在損傷局部進(jìn)行針刺治療,采用蘇州針灸用品有限公司的環(huán)球牌一次性無菌針灸針0.25×40 mm,取阿是穴,以損傷為中心,距損傷15 mm處進(jìn)針,斜刺。每天1次,留針,每次15 min,共針刺6天。自然愈合組不采用任何方法治療,自然愈合。
大鼠阿是穴選取的依據(jù):早在2000年前《靈樞經(jīng)·經(jīng)筋第十三》就有關(guān)于治療肌肉損傷的記載要“以痛為腧”,就是現(xiàn)在的“阿是穴”;《靈樞經(jīng)·官針第七》中記載的針法“浮刺”、“合谷刺”等都是斜刺。盧鼎厚在繼承這一方法的20多年的實(shí)踐中把“以痛為腧”發(fā)展為“以損傷的肌束為主、疼痛為輔”確定阿是穴[3],斜刺針法不變。在找到人體阿是穴的理論依據(jù)的同時,查閱相關(guān)針灸動物實(shí)驗(yàn)和獸醫(yī)針灸學(xué)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),動物穴位的確定模擬人體穴位的居多,但穴位的比例比人體穴位的比例小。因此,本研究采用盧鼎厚的“以損傷的肌束為主、疼痛為輔”確定人體阿是穴的理論作為確定本次實(shí)驗(yàn)大鼠的阿是穴選取和定位的依據(jù)。
1.2.3 測試樣本采集與制備
燒杯內(nèi)倒入正己烷,并把燒杯懸吊于溫度可達(dá)-73℃的干冰容器內(nèi),杯底與干冰液面接觸,待裝有正己烷的燒杯底呈現(xiàn)白霜時即可。每組從6只大鼠中隨機(jī)取4只稱重后,用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,0.25 ml/100 g,腹主動脈取血后,速取右側(cè)損傷處腓腸肌并將其切成小塊,投入用干冰預(yù)冷的裝有正已烷(-70℃)的小燒杯中速凍,之后取出用錫紙編號、包好,冰凍暫存。取材完成后把腓腸肌標(biāo)本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存,備用。
1.2.4 PCNA檢測
采用常規(guī)三步免疫組化法,按試劑盒說明進(jìn)行操作。以PBS代替一抗作陰性對照,結(jié)果在鏡下細(xì)胞核內(nèi)信號呈棕黃色顆粒者為PCNA陽性。每張切片選取5個肌衛(wèi)星細(xì)胞陽性最多的視野。所有圖像用MIAS醫(yī)學(xué)頭像分析管理系統(tǒng)進(jìn)行組織切片的圖像分析,測定腓腸肌衛(wèi)星細(xì)胞的面密度,對其進(jìn)行定量分析。
1.2.5 數(shù)理統(tǒng)計(jì)
使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 13.0 for Windows對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。組間組內(nèi)均采用單因素方差分析,P<0.05為有顯著性差異,P<0.01為有非常顯著性差異。
2.1 針刺治療組大鼠骨骼肌損傷后不同天數(shù)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖情況
在光鏡下見正常組和損傷即刻組大鼠腓腸肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核表達(dá)均為陰性。
傷后第1天,針刺治療組大鼠腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核開始出現(xiàn);傷后第2天,肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)目急劇增加達(dá)高峰,與第1天、第4天、第6天比較均有極顯著性差異(P<0.01),之后呈下降趨勢;傷后第4天肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)目降至第2天的約1/2倍,但高于第1天和第6天,與之比較均有顯著性差異(P<0.05);傷后第6天肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)目降至6天來最低水平,與第1天比較無顯著性差異(表1)。
表1 本研究不同天數(shù)針刺治療組與自然愈合組大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增值情況一覽表 (±SD)
表1 本研究不同天數(shù)針刺治療組與自然愈合組大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增值情況一覽表 (±SD)
注:*表示兩組在傷后不同天數(shù)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的比較,**P<0.01,*P<0.05。
傷后第1天 傷后第2天 傷后第4天 傷后第6天針刺治療組 0.007±0.0044 0.0344±0.014** 0.01735±0.0146*0.0065±0.00283自然愈合組 0.0047±0.0036 0.00768±0.00355* 0.0115±0.0058**0.0081±0.0066
2.2 自然愈合組大鼠骨骼肌損傷后不同天數(shù)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖情況
傷后第1天,自然愈合組大鼠腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核也開始出現(xiàn);傷后第2天,大鼠腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核繼續(xù)增加,與第1天比較有顯著性差異(P<0.05);在損傷后第4天達(dá)高峰,與第1天比較有極顯著性差異(P<0.01),與第2天比較有顯著性差異(P<0.05),之后呈緩慢下降趨勢;傷后第6天,肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核略高于第2天水平,與之比較無顯著性差異,但與第1天、第4天比較均有顯著性差異(P<0.05;表1)。
2.3 不同天數(shù)針刺治療組與自然愈合組大鼠骨骼肌損傷后肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖比較
與自然愈合組比較,針刺治療組大鼠腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)呈急升快降趨勢,而自然愈合組則呈緩升緩降趨勢,同時,肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)達(dá)高峰的時間明顯早于自然愈合組。在數(shù)量上,傷后第1天、第4天針刺治療組肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)略高于自然愈合組,傷后第6天略低于自然愈合組,但兩組比較均無顯著性差異(P>0.05),在傷后第2天,卻明顯高于自然愈合組,2組比較有極顯著性差異(P<0.01,表1;圖1)。
圖1 不同天數(shù)針刺治療組與自然愈合組肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖情況比較示意圖
3.1 大鼠損傷后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖活性變化情況
在整個骨骼肌再生的過程中,決定整個肌肉再生最重要的2個階段是巨噬細(xì)胞吞噬壞死組織和衛(wèi)星細(xì)胞被激活。但就肌肉再生這一過程,主要是由衛(wèi)星細(xì)胞來完成的。骨骼肌損傷后肌纖維的再生來源主要是肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化。
從分子生物學(xué)的角度看,肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活以及增殖分裂,最后形成成熟的肌纖維是一個非常復(fù)雜的過程。肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化一般出現(xiàn)在巨噬細(xì)胞開始吞噬壞死的纖維后,說明衛(wèi)星細(xì)胞的激活與巨噬細(xì)胞分泌的某些物質(zhì)有關(guān),此外,肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活還受其他因素的調(diào)節(jié)。
肌肉損傷后引起肌纖維壞死,使趨向死亡的組織部位的衛(wèi)星細(xì)胞出現(xiàn)增殖、愈合、形成新的肌纖維,取代以前的壞死纖維。在肌纖維修復(fù)過程中,壞死部位、整根肌纖維及壞死纖維周圍正常肌纖維的肌衛(wèi)星細(xì)胞都會移行到壞死部位參與修復(fù)反應(yīng)[14,15]。
骨骼肌損傷后,對肌衛(wèi)星細(xì)胞出現(xiàn)的時間有不同的結(jié)論,Hurme發(fā)現(xiàn),骨骼肌損傷后第1天損傷區(qū)域沒有肌衛(wèi)星細(xì)胞出現(xiàn),第4天再生區(qū)肌衛(wèi)星細(xì)胞增生活躍,第7天肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量下降。但也有研究發(fā)現(xiàn),肌肉發(fā)生損傷后24 h內(nèi),在損傷部位出現(xiàn)組織的變性和炎癥反應(yīng)的同時,衛(wèi)星細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn),并且由于受到損傷刺激的影響,衛(wèi)星細(xì)胞已被激活,并開始表現(xiàn)出分裂和增殖。如Timo等[16]通過實(shí)驗(yàn)得出,衛(wèi)星細(xì)胞在肌肉損傷后1天已開始增殖,Bischoff的衛(wèi)星細(xì)胞增殖時間在損傷后18 h出現(xiàn)。
本研究發(fā)現(xiàn),自然愈合組大鼠在損傷后第1天就有肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核出現(xiàn),傷后第2天肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)繼續(xù)增加;在傷后第4天達(dá)高峰,損傷后第6天下降至略高于第2天的水平,這與前人的研究結(jié)果基本一致,即損傷后24 h肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活,第4天達(dá)峰值,第6天肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量下降,與前人的研究結(jié)果基本上是一致的。
3.2 針刺對急性骨骼肌鈍挫傷大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響
本研究證明,針刺可以促進(jìn)損傷肌組織肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖及增殖高峰期提前出現(xiàn)。與自然愈合組相比,針刺治療組大鼠腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)呈急升快降趨勢,傷后第2天達(dá)高峰,傷后第4天降至第2天的一半,而自然愈合組則呈緩升緩降趨勢,同時,肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)達(dá)高峰的時間明顯早于自然愈合組。針刺治療組肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核數(shù)在損傷后第2天就達(dá)高峰,早于自然愈合組的第4天高峰時間。在數(shù)量上,針刺治療組在傷后第2天明顯高于自然愈合組,兩組比較有極顯著性差異(P<0.01),傷后第1天、第4天僅略高于自然愈合組,傷后第6天略低于自然愈合組,但兩組比較均無顯著性差異。表明針刺治療組大鼠腓腸肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增生更為活躍,增殖高峰期出現(xiàn)的時間更早,提示,針刺可以有效促進(jìn)損傷肌組織肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖及增殖高峰期提前出現(xiàn)。依此推測針刺可能通過促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖及增殖高峰期提前出現(xiàn),促進(jìn)肌肉的再生和修復(fù)。
3.3 針刺促進(jìn)急性骨骼肌鈍挫傷大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的可能機(jī)制
近年來,臨床上運(yùn)用針刺治療骨骼肌急、慢性損傷的療效研究頗多,均證實(shí)療效很好,但對其作用機(jī)制的研究尚不全面。一些人體和動物實(shí)驗(yàn)證明,針刺能促進(jìn)損傷骨骼肌的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。李澎濤等[2]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),針刺能顯著改善家兔超負(fù)荷運(yùn)動后損傷骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化,同時還能迅速降低因運(yùn)動后增高的骨骼肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。1995年屈竹青等[5]再次證實(shí),針刺能迅速降低肌肉損傷后肌細(xì)胞胞漿內(nèi)增加的鈣濃度,加快結(jié)構(gòu)恢復(fù)。盧鼎厚[3]通過人體研究指出,阿是穴斜刺能有效治療運(yùn)動員和非運(yùn)動員的急、慢性肌肉損傷,其作用機(jī)制是針刺通過加強(qiáng)收縮蛋白的組裝、合成而促進(jìn)肌肉的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。同時,他也指出,阿是穴斜刺促進(jìn)肌肉結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的作用是通過肌肉本身所固有的外周調(diào)節(jié)機(jī)制實(shí)現(xiàn)的,而并不是通過經(jīng)絡(luò)和神經(jīng)體液的整體調(diào)節(jié)或中樞調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)。王瑞元[10]研究發(fā)現(xiàn),斜刺可以阻遏大鼠大負(fù)荷運(yùn)動引起的F-肌動蛋白(F-actin)延遲性解聚加強(qiáng),并促進(jìn)大鼠大負(fù)荷運(yùn)動后作為骨骼肌再生指標(biāo)的肌球蛋白重鏈MHC基因表達(dá)的恢復(fù)和骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化的恢復(fù)。
骨骼肌損傷后再生的過程主要是由肌衛(wèi)星細(xì)胞來完成的,而大量研究證實(shí),肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、分化受多種因素的影響,如胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、成纖維生長因子(FGF)、生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)等細(xì)胞因子以及低功率激光、脈沖超聲波、不同頻率張應(yīng)變刺激等物理因素[1,8,11]。Jennische等[17]曾在大鼠的骨骼肌損傷模型中發(fā)現(xiàn),IGF-1在傷后24 h內(nèi)即可出現(xiàn),分布在傷側(cè)肌組織的衛(wèi)星細(xì)胞中。低功率激光照射能顯著地促進(jìn)急性骨骼肌鈍挫傷大鼠損傷局部肌組織IGF-1 mRNA的表達(dá)[4]。IGF-1不僅可促使細(xì)胞分裂增殖,還對生肌調(diào)節(jié)因子的功能有一定的影響。IGF-1調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的機(jī)制可能是利用如鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、3-羥基—磷酸肌醇激酶、有絲分裂原激酶等多條信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié),也可能是直接刺激衛(wèi)星細(xì)胞增生過程[13]。羅麗[4]用低功率激光照射急性骨骼肌鈍挫傷大鼠發(fā)現(xiàn),在損傷后第1天、第2天、第3天和第7天,激光治療組肌衛(wèi)星細(xì)胞核數(shù)目均顯著高于自然愈合組,但變化趨勢大致相同;同時還發(fā)現(xiàn),低功率激光照射能顯著地促進(jìn)急性骨骼肌鈍挫傷大鼠損傷局部肌組織IGF-1 mRNA的表達(dá)。據(jù)此作者推測,低功率激光可能通過促進(jìn)IGF-1 mRNA的表達(dá),從而促進(jìn)新生肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成,并通過提高肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖活性,促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞再生;也可能直接通過促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖,加速骨骼肌的再生與修復(fù),提高骨骼肌愈合質(zhì)量。另有研究發(fā)現(xiàn),脈沖超聲波也可明顯促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖,加快骨骼肌挫傷的愈合速度,提高其愈合質(zhì)量[12],但其作用機(jī)制尚不清楚。關(guān)于針刺調(diào)節(jié)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖的相關(guān)研究報(bào)道卻很少,僅見史翼鵬等[9]在大強(qiáng)度運(yùn)動后用針刺干預(yù)損傷骨骼肌發(fā)現(xiàn)針刺能有效促進(jìn)生肌調(diào)節(jié)因子Myf-5的升高,增強(qiáng)衛(wèi)星細(xì)胞的激活與增殖,從而促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù),但作者并沒有對衛(wèi)星細(xì)胞增殖趨勢進(jìn)行連續(xù)觀察。針刺是否可以通過促進(jìn)生肌調(diào)節(jié)因子Myf-5的升高而使衛(wèi)星細(xì)胞在短期內(nèi)迅速增殖?需要進(jìn)一步研究。
結(jié)合前人的研究結(jié)果和本研究中針刺誘發(fā)肌衛(wèi)星細(xì)胞短時間內(nèi)數(shù)量增加的事實(shí)推測:針刺有可能通過促進(jìn)損傷骨骼肌內(nèi)源性IGF-1 mRNA提早表達(dá)或/和生肌調(diào)節(jié)因子Myf-5的升高,從而使肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖速度更快,增殖高峰期提早出現(xiàn);針刺更有可能直接刺激壞死部位的肌衛(wèi)星細(xì)胞和壞死肌纖維周圍正常肌纖維的肌衛(wèi)星細(xì)胞迅速移行到壞死部位一起參與修復(fù)反應(yīng),但其依據(jù)均需要進(jìn)一步研究證實(shí)。
1.經(jīng)針刺治療后,大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖在第2天達(dá)到高峰,而后呈下降趨勢,提示,針刺可促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖活躍期提前出現(xiàn)。
2.自然愈合組大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖在第1~4天呈遞增情況,在第4天達(dá)到高峰后呈緩慢遞減趨勢。
3.與自然愈合組相比較,大鼠骨骼肌損傷后針刺組肌衛(wèi)星細(xì)胞值在第1天、第2天和第4天均高于自然愈合組,且在第2天有極顯著性差異。提示,大鼠骨骼肌損傷后,針刺能促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖并促使活躍期提前出現(xiàn),促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞再生,加速損傷愈合的進(jìn)程。
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