江 輝， 周益林， 段霞瑜

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

小麥矮腥黑穗病是由Tilletia controversa Kühn（TCK）引起的重要國(guó)際檢疫性病害。該病害危害大，防治難，一旦傳入發(fā)生流行會(huì)給小麥生產(chǎn)帶來(lái)毀滅性危害。為了能有效地控制其發(fā)生和蔓延，國(guó)內(nèi)外對(duì)該病害的生物學(xué)和流行學(xué)特性做了大量工作，并研究了影響TCK發(fā)生和流行的氣象等環(huán)境條件［1－3］。已有研究表明，溫度是影響此病害發(fā)生和流行的重要因子之一，而且溫度主要影響病菌冬孢子的萌發(fā)和侵染過(guò)程［4－6］。王吉霞等研究了溫度對(duì)小麥矮腥黑穗病菌冬孢子萌發(fā)的影響，并建立了TCK冬孢子萌發(fā)率和溫度之間的關(guān)系模型，試驗(yàn)結(jié)果表明，TCK冬孢子在－2～12℃范圍內(nèi)都可以萌發(fā)，5℃為最佳萌發(fā)溫度［7－8］，同時(shí)他們對(duì)5個(gè)菌株的研究還發(fā)現(xiàn)TCK冬孢子不但在不同溫度下的萌發(fā)特性和萌發(fā)率有差異，而且不同分離菌株冬孢子萌發(fā)對(duì)相同溫度的反應(yīng)也有一定差異［7－8］。為了進(jìn)一步明確不同分離菌株冬孢子萌發(fā)對(duì)溫度的反應(yīng)，本研究在2009年通過(guò)室內(nèi)控制不同溫度條件，選取采自不同年份的45個(gè)TCK菌株，對(duì)這些菌株的萌發(fā)過(guò)程及萌發(fā)特性進(jìn)行觀察記錄，來(lái)研究不同菌株冬孢子萌發(fā)對(duì)溫度的敏感性，以便深入了解此病害發(fā)生和流行的成因，為防止該病害的傳入、傳播以及預(yù)測(cè)和防治決策提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 供試材料

2002－2009年收集的45個(gè)小麥矮腥黑穗病菌分離菌株來(lái)自于美國(guó)或我國(guó)口岸截獲，其中T4～T20、T31為2002年采集菌株；T43、T54、T55為2003年采集菌株；T21～T23、T26～T30、T57為2004年采集菌株；T24、T44、T58、T59為2005年采集菌株；T32～T36、T60為2007年采集菌株；T38～T40、T61為2008年采集菌株；T41～T42為2009年采集菌株。

1．2 菌株冬孢子的萌發(fā)

小麥矮腥黑穗病菌菌株冬孢子的表面消毒處理和萌發(fā)參照王吉霞等的方法［7－8］：從不同分離菌樣品的同一發(fā)病麥穗取1粒菌癭，置于2 mL離心管中，滴適量蒸餾水靜置30 min浸泡菌癭，然后搗碎并充分振蕩，用150目網(wǎng)篩過(guò)濾后在室溫下培養(yǎng)24 h，低速離心后棄去上清液，加0．25%次氯酸鈉水溶液并在室溫下放置1 min表面消毒，然后用滅菌水洗3次，將冬孢子懸浮在滅菌水中并調(diào)至冬孢子濃度25萬(wàn)～30萬(wàn)個(gè)／mL，將配制的冬孢子懸浮液加入預(yù)先做好的培養(yǎng)基平板（100 mL培養(yǎng)基中含有2．5 g瓊脂、5 mg 80萬(wàn)IU青霉素）上，每皿加冬孢子懸浮液0．25 mL（冬孢子合10個(gè)／mm2），并用無(wú)菌的三角玻璃棒均勻涂抹培養(yǎng)基表面，每個(gè)分離菌株做6個(gè)重復(fù)。用封口膜封好后倒置分別放于5℃和10℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光照強(qiáng)度為600l x。

從培養(yǎng)15 d之后開(kāi)始，每5 d觀察1次，每個(gè)培養(yǎng)皿觀察300～500個(gè)孢子。鏡檢以先菌絲長(zhǎng)到冬孢子直徑的1／2時(shí)視為萌發(fā)，記錄萌發(fā)起始時(shí)間、萌發(fā)數(shù)目及生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同溫度下TCK菌株冬孢子的萌發(fā)

參試菌株（2003、2005年和2009年菌株較少未列出）冬孢子在培養(yǎng)溫度分別在5℃和10℃時(shí)的萌發(fā)率變化過(guò)程如圖1所示。在TCK最適溫度5℃條件下，觀察冬孢子萌發(fā)過(guò)程的結(jié)果表明，參試45個(gè)TCK菌株的冬孢子最短萌發(fā)起始時(shí)間為20 d，大多數(shù)菌株為25 d。萌發(fā)后首先長(zhǎng)出先菌絲，先菌絲長(zhǎng)短差異較大，可以長(zhǎng)到1～10倍冬孢子直徑不等。有的可觀察到多個(gè)萌發(fā)孔，在同一個(gè)冬孢子上產(chǎn)生多條先菌絲。起初先菌絲沒(méi)有隔膜，正常萌發(fā)的冬孢子在培養(yǎng)35 d以后先菌絲一端開(kāi)始產(chǎn)生隔膜，并可觀察到先菌絲的頂端長(zhǎng)出初生擔(dān)孢子和冬孢子融合后形成的H體和接合釘。絲狀的初生擔(dān)孢子是從先菌絲頂部開(kāi)始生長(zhǎng)，形成密集的一束，45 d時(shí)開(kāi)始有少量的初生擔(dān)孢子頂端長(zhǎng)出臘腸狀的次生擔(dān)孢子。此結(jié)果與王吉霞［7－8］和王軍平［9］的結(jié)果基本一致。

萌發(fā)結(jié)果顯示（圖1），5℃下培養(yǎng)的菌株萌發(fā)率明顯高于10℃下培養(yǎng)的菌株，配對(duì)法t檢驗(yàn)的分析結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)40 d后兩溫度參試菌株的萌發(fā)率達(dá)顯著水平，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，兩個(gè)溫度下培養(yǎng)的菌株萌發(fā)率差異顯著性增加，達(dá)極顯著水平（見(jiàn)表1）。同時(shí)參試菌株在兩個(gè)溫度下萌發(fā)過(guò)程也存在一定差異，在5℃下培養(yǎng)時(shí)，萌發(fā)率隨培養(yǎng)天數(shù)增長(zhǎng)較快；而在10℃下培養(yǎng)時(shí)，萌發(fā)率增長(zhǎng)較慢（圖1）。

表1 兩個(gè)培養(yǎng)溫度下所有菌株萌發(fā)率的配對(duì)法t檢驗(yàn)結(jié)果

2．2 不同年份TCK菌株冬孢子的萌發(fā)

不同年份收集的菌株萌發(fā)率不同，而且年份越早，萌發(fā)率越低。5℃條件下2002年收集的菌株絕大多數(shù)不能萌發(fā)，萌發(fā)率最高為5．6%。2003、2004、2007年和2008年的菌株萌發(fā)率最高值分別為49%、79．8%、84．5%和93．8%。10 ℃條件下2002年收集的菌株萌發(fā)率最高為13．1%，絕大多數(shù)菌株也不能萌發(fā)，2003、2004、2007年和2008年的菌株萌發(fā)率最高值分別為14．22%、10．55%、66%和92．2%。這些結(jié)果表明，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的萌發(fā)率越來(lái)越低，室內(nèi)條件儲(chǔ)存8年左右的一些菌株依然具有萌發(fā)能力。

圖1 不同年份采集的TCK菌株冬孢子在5℃和10℃下培養(yǎng)75d時(shí)的萌發(fā)率

2．3 相同年份采集的不同菌株的冬孢子萌發(fā)

比較相同年份收集的菌株在相同溫度下的萌發(fā)過(guò)程和萌發(fā)率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同菌株之間萌發(fā)差異較大。如2008年采集的菌株在5℃條件下T61與其他3個(gè)菌株T38、T39和T40萌發(fā)率和萌發(fā)過(guò)程存在較大差異，T38、T39和T403個(gè)菌株萌發(fā)率曲線相似，其萌發(fā)速度快且萌發(fā)率高，培養(yǎng)75 d時(shí)其萌發(fā)率分別能達(dá)到93．8%、88．5%和90．8%，而 T61萌發(fā)慢且培養(yǎng)75 d時(shí)，其萌發(fā)率僅為63．3%。在10℃條件下T38、T39、T40和T61 4個(gè)菌株之間均存在一定差異，萌發(fā)速度最快的是T38，其次是T39和T40，最慢的是T61，培養(yǎng)75d時(shí)T38、T39、T40和T61的萌發(fā)率分別為92．2%、51．5%、59%，和16．4%（圖1e和1f）。此結(jié)果表明，不同的菌株萌發(fā)對(duì)溫度確實(shí)具有不同的敏感性。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)TCK不同菌株冬孢子在5℃和10℃條件下培養(yǎng)萌發(fā)，研究表明，菌株在不同溫度下萌發(fā)率不同，說(shuō)明溫度對(duì)菌株冬孢子的萌發(fā)率和萌發(fā)過(guò)程有明顯影響。而且5℃下菌株萌發(fā)速度和萌發(fā)率明顯高于10℃，這與前人的研究結(jié)果一致［7－8］。試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)個(gè)別菌株如T36和T40菌株在培養(yǎng)至25 d時(shí)，10℃下的萌發(fā)率反而高于5℃下的萌發(fā)率，但25 d以后5℃下的萌發(fā)速率明顯加快，5℃下菌株萌發(fā)率明顯高于10℃。

不同年份采集的TCK菌株冬孢子的萌發(fā)結(jié)果顯示，隨著保存時(shí)間的增長(zhǎng)，菌株的萌發(fā)率會(huì)逐年降低，但室溫條件下保存8年左右的菌株仍有萌發(fā)能力，說(shuō)明該病原菌具有較強(qiáng)的生存能力，同時(shí)也說(shuō)明了防止該病害傳入的重要性。

此試驗(yàn)另一重要結(jié)果是采自同一年份的不同菌株萌發(fā)率差異較大，也發(fā)現(xiàn)有些菌株如T13號(hào)菌株在10℃下培養(yǎng)的最終萌發(fā)率甚至還高于在5℃下培養(yǎng)的萌發(fā)率，這說(shuō)明不同菌株的萌發(fā)對(duì)溫度確實(shí)具有不同的敏感性。作者推測(cè)TCK的冬孢子可以在土壤里存活較長(zhǎng)時(shí)間，可能與此機(jī)制有關(guān)，也就是說(shuō)在不同年份不同的溫度條件下，TCK通過(guò)不同菌株萌發(fā)率和萌發(fā)過(guò)程的差異，使其在較長(zhǎng)的時(shí)期具備有侵染活力的病原菌，從而保證病害的發(fā)生和流行，此機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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［6］ 楊巖，龐家智．小麥腥黑穗病和黑粉?。跰］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，1999．

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［9］ 王軍平．小麥矮腥黑穗病菌的生物學(xué)和流行學(xué)初步研究［D］．蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003．