郭 慶， 王忠躍， 孔繁芳， 武艷霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

葡萄根瘤蚜［Daktulosphaira vitif oliae （Fitch）］，屬于同翅目（Homoptera），根瘤蚜科（Phylloxeridae），是葡萄上的毀滅性害蟲。葡萄根瘤蚜為專食性，只為害葡萄屬（Vitis spp．）植物，是我國植物檢疫性有害生物［1］。該種原產(chǎn)于北美洲落基山脈東部［2－3］，目前在加拿大、阿根廷、智利、秘魯、墨西哥、哥倫比亞、巴西、法國、奧地利、阿爾巴尼亞、比利時(shí)、保加利亞、匈牙利、阿爾及利亞、南非、突尼斯、摩洛哥、巴基斯坦、敘利亞、土耳其、黎巴嫩、塞浦路斯、以色列、日本及朝鮮等國均有分布［4－8］。2005年6月在上海市嘉定區(qū)馬陸鎮(zhèn)李家村發(fā)現(xiàn)了葡萄根瘤蚜，以后陸續(xù)在湖南懷化、陜西西安、遼寧葫蘆島等地發(fā)現(xiàn)該蟲［9－11］。葡萄根瘤蚜的再次發(fā)現(xiàn)，引起了農(nóng)業(yè)部的高度重視，并設(shè)專項(xiàng)資金進(jìn)行普查和防控技術(shù)研究。由于此蟲體形小，主要在根部寄生，對(duì)葡萄的為害往往需要較長時(shí)間才開始顯現(xiàn)癥狀，因此不像其他害蟲容易被發(fā)現(xiàn)［12］。目前檢測葡萄根瘤蚜主要方法有DNA檢測、根系調(diào)查和捕蟲器調(diào)查［13］，而DNA檢測大幅度地提高了檢測的靈敏度。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)由美國Applied Biosystems公司于1996年推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高，具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。雖然實(shí)時(shí)熒光定量PCR在害蟲檢測中的應(yīng)用剛剛起步，但已經(jīng)顯示出了極好的應(yīng)用前景。Karen Her bert等報(bào)道利用葡萄根瘤蚜的ITS2建立了特異性引物，建立定性檢測葡萄根瘤蚜的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)［14］，但并未構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、標(biāo)準(zhǔn)曲線和完整的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的絕對(duì)定量檢測體系，本研究采取Taq Man－MGB探針方法，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒及標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立完整的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測體系，對(duì)葡萄根瘤蚜及土壤中的若蟲進(jìn)行定量檢測，旨在為葡萄根瘤蚜的檢測和種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測提供方法。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試害蟲

葡萄根瘤蚜采自湖南懷化、西安灞橋、上海馬陸3個(gè)葡萄根瘤蚜疫區(qū)。

1．1．2 試劑及儀器

Premix Taq Man探針反應(yīng)液，購自上?；瞪锛夹g(shù)有限公司；E．coli感受態(tài)細(xì)胞，p MD18－T載體，購自Ta Ka Ra公司；Powersoil土壤DNA分離試劑盒（12888），購自 MOBIO公司；Eppendorf 5415 R離心機(jī)，水浴鍋，漩渦震蕩儀，ABI7500熒光定量儀，Ultrospec 2100 pro紫外分光光度儀，BIO－RAD C1000TMPCR儀等。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 引物的驗(yàn)證

利用Karen Her bert等根據(jù)葡萄根瘤蚜ITS2中的保守序列設(shè)計(jì)的探針和引物序列，并由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。引物序列和探針序列見表1。

表1 引物和探針序列

參照安瑞生等的方法［15］提取上海馬陸、西安灞橋和湖南懷化3個(gè)地點(diǎn)葡萄根瘤蚜的基因組DNA，以TE溶解，－20℃儲(chǔ)存，用作PCR的模板。PCR反應(yīng)體系為25μL：滅菌雙蒸水8．75μL、DNA模板3μL，反應(yīng)緩沖液1．5μL，d NTP混合物1μL、上游引物0．3μL，下游引物0．3μL、Ex－Taq DNA 聚合酶0．15μL，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參照Bul man等［16］。同時(shí)設(shè)立無模板的陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

1．2．2 標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒的制備

1．2．2．1 ITS2目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增

葡萄根瘤蚜提取方法及PCR體系同1．2．1，反應(yīng)結(jié)束后，用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

1．2．2．2 ITS2目標(biāo)基因的克隆與鑒定

參照膠回收試劑盒的操作說明，回收PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收的PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與p MD18－T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E．coli感受態(tài)細(xì)胞，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，對(duì)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，將陽性重組質(zhì)粒送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司測序。

1．2．3 標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒濃度、拷貝數(shù)計(jì)算及稀釋

利用紫外分光光度儀分別測定陽性質(zhì)粒在260 nm和280 n m處的吸光度，只有A260／A280比值在1．7～1．9之間的質(zhì)?？梢杂糜跇?gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。并計(jì)算出重組質(zhì)粒的DNA純度、濃度和拷貝數(shù)。

1．2．3．1 標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒濃度計(jì)算

將A260／A280比值在1．7～1．9之間的質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒濃度測定及拷貝數(shù)換算，根據(jù)公式：

質(zhì)粒濃度（ng／μL）＝A260×50μg／mL×稀釋終體積（mL）×1000／稀釋時(shí)加入的原始溶液體積（μL）

1．2．3．2 標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算

計(jì)算出質(zhì)粒的濃度，再根據(jù)公式：

質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝／μL）＝質(zhì)粒濃度（ng／μL）×6．02×1014／660×堿基數(shù)（載體＋插入片段）

計(jì)算出質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

將重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋制備不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒模板，用于熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1．2．4 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1．2．4．1 反應(yīng)體系及優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)

反應(yīng)體系為10μL：Pre Mix 5μL，正向引物0．45μL，反向引物0．45μL，Taq Man－MGB 0．25μL，模板2μL，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃15 min，變性95℃15 s，延伸60℃1 min，40個(gè)循環(huán)，對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，以獲得較低的閾值（C t）和較高的熒光強(qiáng)度增加值（R n）。

1．2．4．2 引物濃度的優(yōu)化

對(duì)熒光定量PCR體系中的引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，分別做50、300、600、900 n m、1、10、20、30μm 引物濃度的優(yōu)化組合，優(yōu)化濃度時(shí)，探針濃度為20μm。

1．2．4．3 探針濃度優(yōu)化

上述確定最佳引物濃度后，固定引物濃度，探針濃度設(shè)置為600、900 n m、1、10、20、30μm。

1．2．4．4 退火溫度

退火溫度選擇在55～60℃范圍內(nèi)以1℃作為梯度進(jìn)行優(yōu)化。

1．2．5 重復(fù)性和敏感性試驗(yàn)

1．2．5．1 重復(fù)性試驗(yàn)

以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行系列梯度稀釋，取3個(gè)濃度梯度進(jìn)行熒光定量PCR檢測，各濃度重復(fù)測定3次，分析梯度內(nèi)的C t值標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，評(píng)價(jià)方法的精密度。

1．2．5．2 敏感性試驗(yàn)

將制備的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍倍比稀釋，作為PCR模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，檢驗(yàn)建立方法的敏感性。

1．2．6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將上述制備標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒10倍倍比稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．7 含有葡萄根瘤蚜的土壤DNA檢測

在0．25 g不含葡萄根瘤蚜的烘干土壤中加入10頭葡萄根瘤蚜若蟲，加入葡萄根瘤蚜若蟲的0．25 g非疫區(qū)土壤為陽性對(duì)照，0．25 g不含葡萄根瘤蚜的烘干土壤為陰性對(duì)照，參照Powersoil土壤DNA分離試劑盒操作說明，提取土壤DNA，并梯度稀釋，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1．2．8 田間土壤樣品檢測

取西安受葡萄根瘤蚜為害的深10 c m處的葡萄根際土壤，非疫區(qū)土壤為陰性對(duì)照，參照Powersoil土壤DNA分離試劑盒操作說明，提取土壤總DNA。以提取的土壤總DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

1．3 結(jié)果分析方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用ABI 7500型熒光定量PCR儀自帶軟件SDS進(jìn)行結(jié)果分析，根據(jù)陰性對(duì)照結(jié)果設(shè)定閾值線，擴(kuò)增曲線及樣品C t值由軟件自動(dòng)生成。

2 結(jié)果與分析

2．1 引物的驗(yàn)證

以上海、湖南、西安3個(gè)地點(diǎn)采集的葡萄根瘤蚜提取的基因組DNA為模板，分別采用普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段ITS2基因，將PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段約為114 bp（圖1），實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示為陽性，證明引物和探針適合我國的葡萄根瘤蚜。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

2．2 ITS2目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增、克隆及鑒定結(jié)果

以葡萄根瘤蚜提取的全基因組DNA為模板，擴(kuò)增目標(biāo)片段ITS2基因，將PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增片段約為114 bp，與預(yù)期的大小相一致，見圖2。

回收的PCR產(chǎn)物連接到p MD18－T質(zhì)粒載體中，PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果經(jīng)在Gen Bank數(shù)據(jù)庫上對(duì)比，與已發(fā)表的葡萄根瘤蚜的ITS2基因序列完全一致，結(jié)果表明重組質(zhì)粒中含有葡萄根瘤蚜ITS2基因片段。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖

2．3 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

2．3．1 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板濃度、拷貝數(shù)計(jì)算及稀釋

質(zhì)粒經(jīng)100倍稀釋后，在260 n m和280 n m波長下A值的比值結(jié)果為A260／A280＝1．86，表明提取質(zhì)粒純度較好，適合于熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

根據(jù)公式計(jì)算得到陽性質(zhì)粒濃度為50 ng／μL，陽性質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1．625×1010拷貝／μL。

將重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別制備1．625×1010、1．625×109、1．625×108、1．625×107、1．625×106、1．625×105、1．625×104、1．625×103、1．625×102、1．625×101拷貝／μL和1．625拷貝／μL的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒模板，用于熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

2．3．2 引物濃度的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)引物濃度為10μm，見圖3。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物濃度優(yōu)化

2．3．3 探針濃度的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)探針濃度為10μm，見圖4。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針濃度優(yōu)化

2．3．4 退火溫度的優(yōu)化

退火溫度選擇在55～60℃范圍內(nèi)以1℃作為梯度進(jìn)行優(yōu)化的平均C t分別為15．2、14．72、14．89、14．82、14．98和13．97，所以本試驗(yàn)選擇60℃為最佳退火溫度。

2．4 重復(fù)性和敏感性試驗(yàn)

2．4．1 重復(fù)性試驗(yàn)

3次重復(fù)性測定1．625×105、1．625×103、1．625×101拷貝／μL高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)粒DNA模板。得到各濃度梯度的C t值，并計(jì)算得各濃度的標(biāo)準(zhǔn)差及C t值變異系數(shù)見表3。可見C t值的變異系數(shù)都小于5%，在誤差允許范圍內(nèi)。說明建立的熒光定量PCR檢測方法對(duì)高、中、低不同濃度檢測結(jié)果重復(fù)性較好。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

2．4．2 敏感性試驗(yàn)

取1．625×103、1．625×102、1．625×101、1．625、1．625×10－1拷貝／μL和1．625×10－2拷貝／μL濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)模板 DNA 濃度在1．625×103～1．625拷貝／μL范圍內(nèi)時(shí)，擴(kuò)增曲線的線形較好，很快達(dá)到平臺(tái)期，1．625×10－1拷貝／μL和1．625×10－2拷貝／μL擴(kuò)增曲線與陰性對(duì)照相似所以判斷為陰性，此時(shí)的模板濃度已超出了檢測體系的檢測線性范圍，見圖5。因此，該方法穩(wěn)定的最低檢測靈敏度為1．625拷貝／μL。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)

2．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，取1．625×104、1．625×105、1．625×106、1．625×107、1．625×108拷貝／μL的陽性質(zhì)粒DNA作為模板，分別加入到PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，系統(tǒng)自動(dòng)分析軟件顯示C t值與標(biāo)準(zhǔn)陽性模板濃度的對(duì)數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為－3．436，相關(guān)系數(shù)（R2）為0．99，擴(kuò)增效率為95．462%（圖6）。試驗(yàn)結(jié)果說明，根據(jù)C t值和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2．6 含有葡萄根瘤蚜的土壤DNA檢測

將提取的土壤DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所提取的DNA稀釋103倍后，仍能檢測出陽性結(jié)果。結(jié)果表明，采取熒光定量PCR的方法能夠檢測到土壤中葡萄根瘤蚜的存在，可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)土壤中的葡萄根瘤蚜進(jìn)行定性定量分析，見圖7。

2．7 田間土壤樣品檢測

試驗(yàn)結(jié)果表明，利用上述引物可以在受葡萄根瘤蚜為害的葡萄根際土壤中檢測到葡萄根瘤蚜的存在，證明了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測土壤中葡萄根瘤蚜的可行性，見圖8。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，初步應(yīng)用Taq Man－MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)含有葡萄根瘤蚜DNA的模板進(jìn)行檢測，呈現(xiàn)良好的S型擴(kuò)增曲線，能夠進(jìn)行定量檢測，其靈敏度可達(dá)1．625拷貝／μL。本試驗(yàn)驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測土壤中葡萄根瘤蚜的可行性，還進(jìn)一步檢測了含有10頭葡萄根瘤蚜若蟲的土壤所提取的總DNA，并對(duì)所提DNA梯度稀釋，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明將所提取的DNA稀釋103倍，仍能檢測出陽性結(jié)果。在上述研究基礎(chǔ)之上，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)受葡萄根瘤蚜為害的葡萄根際土壤進(jìn)行了初步定性檢測，驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測土壤中葡萄根瘤蚜的可行性。利用該方法可以通過對(duì)土壤中葡萄根瘤蚜若蟲量進(jìn)行檢測，從而達(dá)到對(duì)葡萄根瘤蚜種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測的目的，該方法避免了挖根調(diào)查對(duì)葡萄的傷害，也大幅降低了調(diào)查所需投入的人力物力，提高了準(zhǔn)確度，給葡萄根瘤蚜疫情的檢測及監(jiān)測提供了較好的方法。但是，若想使田間所采集的土壤樣品能夠檢測到葡萄根瘤蚜并準(zhǔn)確反映其種群動(dòng)態(tài)變化，還需要對(duì)田間土壤采樣方法、土壤總DNA提取方法以及熒光定量PCR檢測結(jié)果與葡萄根瘤蚜種群量的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行深入研究。

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