劉煥星，曹 平

哮喘是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，它以加劇的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氧化應(yīng)激為特點(diǎn)［1］。哮喘的發(fā)生與炎性細(xì)胞，包括嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞的浸潤有關(guān)［2］。已有研究表明，2型輔助性T淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，包括嗜酸粒細(xì)胞的募集、IgE和活化氧的產(chǎn)生以及肥大細(xì)胞的激活，共同構(gòu)成氣道高反應(yīng)性的必要遞質(zhì)［3－5］。建立機(jī)體對過敏原的特異性耐受，可抑制哮喘的發(fā)生與發(fā)展。

樹突狀細(xì)胞 (dendritic cells，DC)是專職的骨髓來源抗原提呈細(xì)胞，是一群異源性、異質(zhì)性的細(xì)胞群體。盡管DC是在Steinman［6］研究免疫原性時發(fā)現(xiàn)的，這些細(xì)胞在維持免疫耐受方面同樣發(fā)揮了重要作用［7］。新近提出的調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞 (regulatory dendritic cells，rDC)具有負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能，在體內(nèi)外誘導(dǎo)T細(xì)胞低反應(yīng)性及耐受性。

我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)，肺臟基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以誘導(dǎo)成熟樹突狀細(xì)胞 (mature dendritic cells，mDC)分化發(fā)育成一種rDC，其細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分子表型表達(dá)、細(xì)胞因子分泌都不同于mDC，缺乏活化T細(xì)胞的重要信號［8］。本實(shí)驗(yàn)利用這種rDC的致耐受能力，通過誘導(dǎo)小鼠過敏性哮喘模型，研究其對卵清蛋白 (OVA)激發(fā)的氣道過敏性炎癥的影響及白介素12(IL－12)、IgE表達(dá)的變化，探討其在哮喘中的作用。

1 材料與方法

1.1 rDC的制備 簡要的說用含重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (rmGM－CSF)(10 ng/ml)、重組小鼠細(xì)胞因子白介素4(rmIL－4)(1 ng/ml)的RPMI1640完全培養(yǎng)基與小鼠骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)8 d，用CD11c磁珠陽性選擇CD11c+細(xì)胞，脂多糖 (LPS) (1 ng/ml)刺激24 h使其成為mDC，然后用含有50%肺臟基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的上清液作為完全培養(yǎng)基共培養(yǎng)1周，得到免疫表型為CD11clowIalowCD11bhigh的rDC［8］。

1.2 主要試劑及儀器 OVA、LPS等購自Sigma公司;IL－12、IgE ELISA試劑盒購自R＆D公司;rmIL－4、rmGM－CSF購自美國Peprotech公司;普通倒置光學(xué)顯微鏡 (Olympus IX70)，普通光學(xué)顯微鏡 (OlympusCH20)，BIO－RAD 680酶標(biāo)儀，魚躍牌超聲霧化器。

1.3 哮喘小鼠模型的建立 除正常組小鼠外，其余各組均經(jīng)如下處理誘導(dǎo)哮喘樣癥狀:以首次注射OVA抗原當(dāng)日為第0天 (Day0)計(jì)，于Day0和Day9分別予0.1%OVA的氫氧化鋁〔Al(OH)3〕溶液 (0.1 ml/只)腹腔注射，進(jìn)行初次致敏和加強(qiáng)致敏。Day14～20:連續(xù)7 d予2%OVA的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行霧化攻擊，1次/d，30 min/次。抗原激發(fā)后觀察小鼠反應(yīng)，表現(xiàn)為呼吸加深加快，頭面部瘙癢，安靜少動，弓背，二便失禁為陽性反應(yīng)，表明哮喘模型建立成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物與分組 40只6～8周齡的C57BL/6近交系小鼠，雌性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。動物分組及rDC的免疫如下:按隨機(jī)數(shù)字表法分成A、B、C、D組，每組10只。A組:正常組，分別在Day0、Day7、Day14，按0.1 ml/只的量腹腔注射磷酸鹽緩沖液 (PBS)。B組:OVA組，未做處理的哮喘組。C組:mDC組，分別在Day0、Day7、Day14，按5×106/鼠的細(xì)胞量腹腔注射mDC。D組:rDC組，分別在Day0、Day7、Day14，按5×106/鼠的細(xì)胞量腹腔注射rDC。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 取材 末次霧化激發(fā)24 h后 (第21天)，采用摘除眼球取血的方法收集標(biāo)本。取血靜置1 h，經(jīng)離心機(jī)分離血清。－20℃保存，待測細(xì)胞因子。脫頸處死小鼠，暴露胸腔和氣管，分離氣管，結(jié)扎右主支氣管，向左肺內(nèi)灌注1 ml的PBS，停留片刻后回吸，獲得肺泡灌洗液。常規(guī)留取右肺中葉，行病理學(xué)觀察。

1.5.2 肺部標(biāo)本的制備 取右肺中葉，用4%多聚甲醛固定48 h后石蠟包埋，切成4 μm厚切片，行蘇木素－伊紅 (HE)染色制片。觀察肺部的炎癥病理改變。

1.5.3 ELISA法檢測小鼠血清中IL－12、IgE及肺泡灌洗液中IL－12的表達(dá)水平 按照R＆D公司ELISA試劑盒操作，在BIO－RAD 680酶標(biāo)儀上讀取結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以 ()表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)觀察 (HE染色) 正常組小鼠支氣管黏膜上皮、肌層及肺泡壁完整。支氣管管腔和肺泡腔規(guī)則，結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤。支氣管管腔、肺泡腔內(nèi)無分泌物潴留(見圖1)。OVA組哮喘小鼠 (見圖2)與mDC組哮喘小鼠(見圖3)的病理學(xué)表現(xiàn)相似。支氣管管壁增厚，管腔狹窄，支氣管上皮細(xì)胞增生明顯，可見較多炎性細(xì)胞浸潤 (以嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主)，支氣管周圍小血管擴(kuò)張、充血，肺泡壁增厚且明顯塌陷，肺泡腔明顯減少，其內(nèi)可見較多炎性細(xì)胞浸潤，支氣管管腔、肺泡腔內(nèi)可見分泌物潴留。rDC組哮喘小鼠支氣管壁明顯變薄，小血管輕度擴(kuò)張、充血，炎性細(xì)胞浸潤較前兩組明顯減少，肺泡壁塌陷較前兩組減輕 (見圖4)。

2.2 血清中IL－12、IgE水平的比較 4組小鼠血清中IL－12、IgE比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。其中rDC組血清中IL－12的水平高于OVA組，IgE低于OVA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。mDC組血清中IL－12、IgE水平與OVA組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)。

圖1 正常組小鼠肺組織 (HE，×100)Figure 1 Lung tissues of normal group mice(HE， ×100)

表1 4組小鼠血清中IL－12及IgE水平的比較 (，pg/ml)Table 1 Comparison of IL－12 and IgE levels between four groups

表1 4組小鼠血清中IL－12及IgE水平的比較 (，pg/ml)Table 1 Comparison of IL－12 and IgE levels between four groups

注:與OVA組比較，*P＜0.01，△P＞0.05

組別 只數(shù)IL－12 IgE正常組 10 28±4 25±5 OVA組 10 20±4 62±8 mDC組 10 18±5△ 58±8△rDC組 10 57±6* 32±5*F 值0.00 0.00 149.4 77.3 P值

2.3 肺泡灌洗液中IL－12水平的比較 4組小鼠肺泡灌洗液中IL－12水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=81.2，P＜0.01)。其中rDC組肺泡灌洗液中IL－12水平高于OVA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);mDC組肺泡灌洗液中IL－12水平與OVA組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表2)。

表2 4組肺泡灌洗液中IL－12水平的比較 (，pg/ml)Table 2 Comparison of IL－12 level in lavage fluid between four groups

表2 4組肺泡灌洗液中IL－12水平的比較 (，pg/ml)Table 2 Comparison of IL－12 level in lavage fluid between four groups

注:與OVA組比較，*P＞0.05，△P＜0.01

組別 只數(shù)IL－12正常組 10 29±6 OVA組 10 17±4 mDC組 10 17±5*rDC組 10 49±7△

圖2 OVA組小鼠肺組織 (HE，×100，右下角×400)Figure 2 Lung tissues of OVA group mice(HE， ×100，the lower right corner×400)

圖3 mDC組小鼠肺組織 (HE，×100，右下角×400)Figure 3 Lung tissues of mDC group mice(HE， ×100，the lower right corner×400)

圖4 rDC組小鼠肺組織 (HE，×100，右下角×400)Figure 4 Lung tissues of rDC group mice(HE， ×100，the lower right corner×400)

3 討論

本研究利用mDC與肺基質(zhì)細(xì)胞上清液共培養(yǎng)獲得的rDC具有誘導(dǎo)免疫耐受的特性，接種至用OVA激發(fā)的哮喘小鼠。本研究結(jié)果顯示，這種rDC可減輕小鼠肺部炎癥表現(xiàn)，上調(diào)Th1型細(xì)胞因子IL－12水平并下調(diào)IgE水平。

哮喘是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性非特異性炎癥。許多研究已證實(shí)T1亞群輔助細(xì)胞/T2亞群輔助細(xì)胞(Th1/Th2)平衡失調(diào)、Th2細(xì)胞活化亢進(jìn)是哮喘發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］。IL－12在Th1型細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)中起決定因素，并有研究表明IL－12不足時Th1反應(yīng)低下而Th2反應(yīng)增強(qiáng)。Zedan等［10］研究發(fā)現(xiàn)，哮喘兒童與正常兒童相比，血清IL－12水平明顯下降，并提出IL－12的產(chǎn)生不足可能是哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要組分。IL－12可有效地促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子如干擾素γ(IFN－γ)的產(chǎn)生，抑制IgE的合成，抑制過敏原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性及嗜酸粒細(xì)胞的浸潤［11］。而IFN－γ又可反過來加強(qiáng)IL－12的作用，這樣便形成了一個正反饋循環(huán)，加強(qiáng)了Th1的應(yīng)答反應(yīng)。另一方面又可抑制Th2型細(xì)胞因子如IL－13、IL－4的產(chǎn)生，抑制Th2的應(yīng)答反應(yīng)，降低B淋巴細(xì)胞合成過多的IgE，減輕氣道炎癥反應(yīng)，降低氣道阻力，改善肺功能。IgE是一種反應(yīng)抗體，通常情況下，主要由鼻咽部、扁桃體、支氣管等黏膜固有層的漿細(xì)胞產(chǎn)生，IgE水平的降低意味著IgE介導(dǎo)超敏反應(yīng)的降低，血清中IgE水平取決于疾病炎癥反應(yīng)的程度。

通過rDC干預(yù)后，IL－12的表達(dá)水平較哮喘小鼠高，且肺泡灌洗液和血清中IL－12的變化一致，而且IL－12能抑制過敏原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性及嗜酸粒細(xì)胞在氣道聚集，使rDC組病理切片及灌洗液中的嗜酸粒細(xì)胞浸潤減少，炎癥減輕。提示rDC抑制哮喘氣道炎癥的作用可能與上調(diào)IL－12的表達(dá)，并抑制IgE產(chǎn)生有關(guān)。從而既糾正了Th1及Th2型細(xì)胞因子失衡又減輕了哮喘的氣道高反應(yīng)性。

綜上所述，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的rDC對哮喘小鼠氣道炎癥有治療作用。rDC應(yīng)用于哮喘治療具有良好的前景。

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