李俐濤，孟笑梅，尹 昱，李 哲，楊 蕊，王建華

缺血性腦血管病是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病之一，根據(jù)國(guó)際衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)平均每400人中就有一個(gè)缺血性腦血管病患者，缺血性腦血管病造成的死亡率僅次于心臟疾病，在所有的缺血性腦血管病患者中大約有30%的患者由于溶栓治療或栓子自發(fā)向遠(yuǎn)端推移而出現(xiàn)血管再通，發(fā)生缺血再灌注損傷。其中過(guò)度的氧化應(yīng)激反應(yīng)存在于腦梗死后壞死及缺血區(qū)域，導(dǎo)致氧化損傷，此結(jié)論已成為共識(shí)，因此，減輕氧化損傷成為治療急性腦梗死的主要途徑之一。Nrf2/ARE通路激活具有神經(jīng)保護(hù)作用，逐漸引起科學(xué)家們的關(guān)注。最新研究表明，缺血再灌注后過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSHPx)、超氧化物歧化酶 (SOD)的活性降低［1］，Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑sulforaphene的確能夠減小腦梗死的面積［2］。通過(guò)提高SOD和GSH－Px的表達(dá)和酶活性，能夠減少多發(fā)性腦梗死大鼠的記憶損害［3］。因此，本研究設(shè)想Nrf2/ARE通路與缺血性卒中病理機(jī)制具有相關(guān)性，且在臨床治療中具有開(kāi)發(fā)的潛力。

氧化苦參堿 (oxymatrine，OMT)是從苦參 (Sophora flavescens Ait)等豆科槐屬植物中提取的生物堿，分子式為C15H24N2O，具有四環(huán)的喹嗪啶類結(jié)構(gòu)。文獻(xiàn)報(bào)道OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用［4－5］。近幾年對(duì)OMT的研究有很多，多集中在抗肝炎及抗腫瘤方面，但關(guān)于OMT對(duì)腦血管疾病的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用行為學(xué)評(píng)分及TTC染色評(píng)價(jià)了OMT的腦保護(hù)作用，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡 (Confocal)及Western blot方法觀察了OMT對(duì)局灶性腦梗死小鼠腦組織Nrf2核轉(zhuǎn)位的形態(tài)學(xué)改變及核蛋白表達(dá)的影響，旨在從Nrf2蛋白水平探討OMT抗氧化的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 健康雄性C57小鼠36只，體質(zhì)量24～26 g，由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供 (許可證號(hào)DK0403－007)，清潔級(jí)。OMT(購(gòu)自陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，純度98%，生產(chǎn)批號(hào)SF20061215)，臨用時(shí)以蒸餾水制成混懸液 (40 g/L)。電子天平 (日本AND HR－120，精確度為0.1 mg);低溫離心機(jī) (德國(guó)eppendorf，Centrifuge 5417R)，凝膠成像分析系統(tǒng) (SYNGENE)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制作 參照Longa等［6］和Koizumi等［7］的線栓法制作小鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞的動(dòng)物模型，用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，做頸前皮膚正中切口，分離暴露右側(cè)頸三角，仔細(xì)分離右側(cè)頸總動(dòng)脈 (CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈 (ICA)，用微動(dòng)脈夾夾閉CCA，之后用雙極電凝筆電凝ECA的分支，并將分支結(jié)扎、斷離;游離ECA主干，在距CCA分叉3～4 mm處結(jié)扎、離斷;沿ICA分離暴露翼腭動(dòng)脈;微動(dòng)脈夾夾閉ICA;ECA殘端剪一0.2 mm小口，將制備好的栓線 (直徑0.18～0.20 mm，長(zhǎng)約1.5 cm的尼龍魚線，頭端呈球形，距頭端1.1 cm處做一標(biāo)記)插入，在ECA剪口處打一松結(jié)以阻斷ICA的血液反流，去除ICA的微動(dòng)脈夾，將線從ECA插入，進(jìn)入ICA的顱內(nèi)段，進(jìn)線長(zhǎng)度為距CCA分叉處 (1.1±0.05)cm，此時(shí)進(jìn)線有輕微阻力，栓線正好插至顱內(nèi)大腦前動(dòng)脈，堵住大腦中動(dòng)脈的開(kāi)口。結(jié)扎、切斷游離的ECA和栓線，去除CCA的微動(dòng)脈夾，消毒縫合頸部皮膚。術(shù)中及術(shù)后用白熾燈照射動(dòng)物以維持其肛溫在(37±1)℃。缺血60 min后拔出線栓，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型。

1.2.2 動(dòng)物分組 將小鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組 (Sham組)、局灶性大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注組 (MCAO組)、OMT(120 mg/kg)治療組。其中Sham組不插線栓，其余均同MCAO組，MCAO組及OMT組均給予腹腔注射給藥，將藥物以0.9%氯化鈉溶液制成相同濃度混懸液 (40 g/L)，OMT組給予OMT 120 mg/kg，Sham組給予1 ml 0.9%氯化鈉溶液，于手術(shù)完畢后即刻腹腔注射給藥，24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分及各項(xiàng)指標(biāo)觀察。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參考Longa等［6］的5級(jí)4分法，在動(dòng)物麻醉清醒后24 h進(jìn)行評(píng)分并記錄神經(jīng)功能缺損癥狀，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分:無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;1分:提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直;2分:行走時(shí)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)跌倒;4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.2.4 腦梗死體積測(cè)定 各實(shí)驗(yàn)組分別取5只小鼠進(jìn)行TTC染色，缺血/再灌注術(shù)后24 h，相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組小鼠斷頭處死，完整取出腦組織，將大腦均勻切成5片冠狀切片。腦片浸入2%TTC溶液，37℃恒溫水浴中孵育30 min染色，染色后于4%多聚甲醛中固定24 h，數(shù)碼相機(jī)攝像，利用圖像分析軟件Image J(ver1.37c，NIH)測(cè)定腦梗死面積和腦梗死體積 (紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，蒼白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū))。應(yīng)用 Belayev等［8］的計(jì)算公式糾正水腫:矯正梗死體積百分比= (矯正梗死體積/非缺血側(cè)半球體積) ×100%。

1.2.5 組織熒光化學(xué)染色 各實(shí)驗(yàn)組分別取3只小鼠進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，缺血/再灌注24 h后，以10%水合氯醛 (350 mg/kg)麻醉，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，從心尖處插入灌注針至左心室，并剪開(kāi)右心耳形成灌注液排出通道，從左心室快速灌注0.9%氯化鈉溶液100 ml，然后以4%多聚甲醛約200 ml灌注固定，于30 min左右灌注完畢，迅速取腦置于20%多聚蔗糖溶液中固定24 h以上，切片前浸泡于4%多聚甲醛溶液直至下沉，切片厚約45 μm，磷酸鹽緩沖液 (PBS)沖洗3次，10%馬血清/TBS 60 min阻斷非特異性染色，兔多克隆抗Nrf2(1∶200)抗體，含0.5%TritonX－100在4℃搖床過(guò)夜，次日TBS洗10 min×3，加入熒光二抗 (1∶1 000) 和4，6－二脒基－2－苯基吲哚 (4，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI)染料以標(biāo)記細(xì)胞核37℃ 30 min，避光TBS洗10 min×3，激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 每組分別取4只小鼠用于核蛋白提取，小鼠于術(shù)后24 h斷頭取腦，于冰上分離缺血側(cè)皮層腦組織，置凍存管中放入液氮，再轉(zhuǎn)移到－80℃冰箱保存，用于提取總蛋白。將樣本剪碎，按7倍體積加入總蛋白提取液，如樣本50 mg配制350 μl蛋白提取液。組織經(jīng)超聲勻漿破碎，4℃放置1 h，4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清，分裝后－80℃凍存，待實(shí)驗(yàn)用，用試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制備不連續(xù)SDS－聚丙烯酰胺凝膠 (4%濃縮膠和10%分離膠)，灌滿后將梳子插入濃縮膠中，待濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出，用水沖洗濃縮膠，將其放入電泳槽中。取各組總蛋白40 μg，與等體積上樣緩沖液 (Buffer B)混合，煮沸10 min，使蛋白充分變性，4℃12 000 r/min離心2 min，將提取的蛋白加于凝膠加樣孔內(nèi)。濃縮膠上所加電壓為80 V，當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后電壓改為100 V，溴酚蘭移動(dòng)至膠底部時(shí)終止電泳，時(shí)間約為100 min。電泳完畢，剝膠，按蛋白Marker切膠，將3層濾紙、PVDF膜、膠及另外3層濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10 min后并依次從正極向負(fù)極疊放，在4℃條件下100 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用麗春紅S染PVDF膜2～5 min，去離子水漂洗脫色，鑒定轉(zhuǎn)膜效果。5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1 h，同時(shí)加入兔多克隆抗Nrf2抗體 (1∶400，封閉液稀釋)4℃孵育過(guò)夜，TPBS洗膜5次，每次5 min，同時(shí)加入羊抗兔IgG熒光抗體 (1∶3 000，封閉液稀釋)，37℃孵育1 h，TPBS洗膜4次，每次5min，PBS洗膜5 min。Odyssey遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描并測(cè)定目標(biāo)帶單位密度。掃描完畢后，用洗膜液洗膜3次，每次10 min，加入鼠抗β－actin多克隆抗體 (1∶400，封閉液稀釋)4℃孵育過(guò)夜，TPBS洗膜5次，每次5 min，加入羊抗鼠IgG熒光抗體 (1∶3 000，封閉液稀釋)，37℃孵育1.5 h，TPBS洗膜4次，每次5min，PBS洗膜5 min。化學(xué)發(fā)光，顯影，定影后Odyssey遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描并測(cè)定目標(biāo)帶單位密度，檢測(cè)β－actin(1∶500，封閉液稀釋)的表達(dá)作為參照，Nrf2/β－actin的比值代表各組的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均以 ()表示，當(dāng)方差齊時(shí)多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析 (ANOVA)，兩兩比較采用q檢驗(yàn);當(dāng)方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 OMT對(duì)局灶性腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能缺失的影響MCAO組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于Sham組〔Sham組:0分，MCAO組: (3.27±0.46) 分，q=8.46，P＜0.05〕;OMT組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于MCAO組〔MCAO組:(3.27±0.46)分，OMT組:(2.11±0.30)分，q=5.04，P＜0.05，見(jiàn)圖1〕。

2.2 OMT對(duì)局灶性腦缺血再灌注小鼠腦梗死體積的影響Sham組小鼠腦組織TTC染色表現(xiàn)為均勻一致的紅色，而MCAO組缺血再灌注側(cè)腦組織TTC染色出現(xiàn)大范圍蒼白色梗死區(qū)域。與MCAO組比較，OMT組梗死體積明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔MCAO組:(0.48±0.04)%，OMT組:(0.30±0.02)%，q=3.46，P ＜0.05，見(jiàn)圖2〕。

圖1 OMT對(duì)局灶性腦缺血后神經(jīng)功能缺失評(píng)分的影響Figure 1 Bar graph showing the effect of OMT on neurological deficit

圖2 OMT對(duì)局灶性腦缺血后腦梗死體積的影響Figure 2 Effects of OMT on cerebral infarction volume in MCAO mice

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察OMT對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位影響 MCAO組可觀察到部分Nrf2核轉(zhuǎn)位，OMT治療后誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位明顯增加 (見(jiàn)圖3)。

2.4 OMT治療后Nrf2核蛋白水平變化 再灌注24 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，OMT治療后能夠明顯誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，增加Nrf2的核蛋白表達(dá)，且OMT組與MCAO組比較，Nrf2核蛋白表達(dá)明顯增加 (MCAO組:0.82±0.47，OMT組:0.53±0.06，q=4.23，P ＜0.05，見(jiàn)圖4)。

圖3 OMT對(duì)局灶性腦梗死后腦組織的Nrf2核轉(zhuǎn)位影響Figure 3 Effects of OMT on nuclear translocation of Nrf2 in MCAO mice

圖4 OMT對(duì)局灶性腦梗死后Nrf2核蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Graphs showing the nucleoprotein expression level of Nrf2 in Sham，MCAO and OMT groups

3 討論

OMT抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用正逐漸受到重視，研究表明OMT具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗凋亡、增強(qiáng)免疫功能等多種生物學(xué)作用，并且毒副作用低，具有良好的臨床應(yīng)用潛力［9］。OMT組織分布以肝臟最高，依次為脾、肺、腦、心、血。臟器藥物濃度約在0.5 h達(dá)峰值，與血藥濃度一致，易通過(guò)血－腦脊液屏障，OMT吸收完全而迅速，長(zhǎng)期給藥不積蓄。

腦缺血損傷見(jiàn)于許多臨床病理過(guò)程，影響這一過(guò)程的因素是多方面的。一般認(rèn)為，腦缺血損傷是典型的氧化應(yīng)激損傷，氧自由基產(chǎn)生、炎癥遞質(zhì)釋放是其重要機(jī)制。然而，在臨床實(shí)驗(yàn)中抗氧化治療并沒(méi)有效果，或許這些藥物抗氧化通路的效果有限。長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)氧化應(yīng)激發(fā)生機(jī)制缺乏清晰的認(rèn)識(shí)，妨礙了人們對(duì)抗氧化物質(zhì)在腦缺血損傷中的作用給出合理的解釋。近年來(lái)認(rèn)為Nrf2在氧化應(yīng)激損傷中起重要作用［10］。

Nrf2于1994年由Moi等［11］作為結(jié)合在 β2珠蛋白基因啟動(dòng)子NF－E2重復(fù)序列的因子被克隆出，它是包括NF－F2、Nrf1、Nrf2、Nrf3、Bach1和Bach2堿性亮氨酸拉鏈 (basic leucine zipper，bZIP)蛋白家族中的一員，并且是活力最強(qiáng)的一個(gè)，具有高度保守的CNC(“cap'n'collar”) 結(jié)構(gòu)區(qū)域［12］。正常情況下，Nrf2和細(xì)胞骨架蛋白Keap1以N端的Neh2區(qū)域結(jié)合成二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，從而使保護(hù)細(xì)胞的酶類和抗氧化物處于基礎(chǔ)表達(dá)水平，細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)。Nrf2與Keap1解離可在以下兩種情況下發(fā)生:一是當(dāng)外界氧化應(yīng)激因子或親核物質(zhì)刺激后，Keap1中的巰基改變;二是通過(guò)蛋白激酶C(PKC)途徑使Nrf2磷酸化。Nrf2和Keap1解離后，Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與Maf、JunD、cJun、ATF4等形成雜化二聚體，然后與ARE啟動(dòng)子部位結(jié)合，ARE可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)參與氧化應(yīng)激的基因轉(zhuǎn)錄水平的激活，Nrf2/ARE信號(hào)的表達(dá)增強(qiáng)，可以上調(diào)多種抗氧化酶、解毒酶的表達(dá)，提高細(xì)胞的抗氧化和解毒能力。

腦缺血/再灌注后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，測(cè)定梗死體積是評(píng)價(jià)腦缺血損傷程度的常用手段。由于大腦中動(dòng)脈供應(yīng)支配運(yùn)動(dòng)的腦組織，因此短暫性腦缺血術(shù)后的動(dòng)物，麻醉清醒后即可觀察到神經(jīng)功能缺損癥狀。與人類類似，小鼠肢體同樣受對(duì)側(cè)大腦皮質(zhì)交叉性支配，右側(cè)中動(dòng)脈缺血/再灌注后，導(dǎo)致左側(cè)肢體肌無(wú)力，故動(dòng)物運(yùn)動(dòng)時(shí)向左側(cè)打圈，表現(xiàn)出典型的追尾征，嚴(yán)重時(shí)向左側(cè)傾倒，甚至發(fā)生昏迷、死亡。在本實(shí)驗(yàn)中OMT治療后，小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分較MCAO組降低，腦梗死體積減小，表明OMT可改善局灶性腦缺血/再灌注損傷后小鼠的神經(jīng)功能缺損，降低腦梗死體積，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)Nrf2在OMT的腦保護(hù)作用中的重要地位，本研究采用Confocal及Western blot技術(shù)檢測(cè)了各實(shí)驗(yàn)組Nrf2核定位及核蛋白的表達(dá)。本研究中Sham組可見(jiàn)少量Nrf2核蛋白表達(dá)，于缺血/再灌注24 h后MCAO組Nrf2核轉(zhuǎn)位增加，同時(shí)核蛋白含量較Sham組增加，與MCAO組比較，OMT組能顯著上調(diào)缺血側(cè)腦組織中Nrf2形態(tài)學(xué)核轉(zhuǎn)位及核蛋白的表達(dá)量。由此可以推斷，局灶性腦缺血后損傷組織釋放的內(nèi)源性激活物被Nrf2識(shí)別后，啟動(dòng)了Nrf2的信號(hào)傳導(dǎo)通路，并進(jìn)一步激活Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，從而釋放一系列抗氧化酶以稀釋減弱因腦缺血產(chǎn)生的腦損傷。而OMT可以促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，增加Nrf2的核蛋白表達(dá)，從而抑制之后一系列氧化損傷，并最終減輕腦損傷。二者之間又是通過(guò)怎樣的方式、途經(jīng)、環(huán)節(jié)發(fā)揮對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)控作用等，尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

目前有關(guān)中藥對(duì)Nrf2在抗氧化方面的作用機(jī)制研究尚處于起步階段，已有的資料不多，因此，對(duì)Nrf2在腦缺血氧化應(yīng)激損傷中作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，將有助于闡明氧化應(yīng)激與機(jī)體損傷之間的聯(lián)系，并可能從氧化應(yīng)激反應(yīng)起點(diǎn)控制的角度揭開(kāi)抗氧化因子參與腦缺血損傷發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。相信隨著對(duì)Nrf2研究的不斷深入，會(huì)為臨床疾病的治療帶來(lái)新的思路。

1 Choi－Kwon S，Park KA，Lee HJ，et al.Temporal changes in cerebral antioxidant enzyme activities after ischemia and reperfusion in a rat focal brain ischemia model:effect of dietary fish oil［J］ .Brain Res Dev Brain Res，2004，152(1):11 －18.

2 Zhao J，Kobori N，Aronowski J，et al.Dasha，Sulforaphane reduces infarct volume following focalcerebral ischemia in rodents［J］.Neurosci Lett，2006，393(2－3):108－112.

3 Liu CZ，Yu JC，Zhang XZ，et al.Acupuncture prevents cognitive deficits and oxidative stress in cerebral multi－infarction rats［J］ .Neurosci Lett，2006，393(1):45 －50.

4 Lu LG，Zeng MD，Mao YM，et al.Oxymatrine therapyfor chronic hepatitis B:a randomized double－blind and placebo－controlled multicenter trial［J］ .World J Gastroenterol，2003，9(11):2480 －2483.

5 Zheng P，Niu FL，Liu WZ，et al.Anti－ inflammatory mechanism of oxymatrine in dextran sulfate sodium －induced colitis of rats［J］.World J Gastroenterol，2005，11(31):4912 －4915.

6 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in Rats ［J］ .Stroke，1989，20(1):84－91.

7 Laing RJ，Jakubowski J，Laing RW，et al.Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Which method works best?［J］.Stroke，1993，24(2):294－297.

8 Tatlisumak T，Carano RA，Takano K，et al.A novel endothelin antagonist，A －127722，attenuates ischemic lesion size in rats with temporary middle cerebral 24 artery occlusion:a diffusion and perfusion MRI study［J］ .Stroke，1998，29(4):850 －857.

9 Li M，Zhang X，Cui L，et al.The neuroprotection of oxymatrine in cerebral ischemia/reperfusion is related to nuclear factor erythroid 2－related factor 2(nrf2) －mediated antioxidant response:role of nrf2 and hemeoxygenase－1 expression ［J］ .Biol Pharm Bull，2011，34(5):595－601.

10 Nguyen T，Sherratt PJ，Pickett CB.Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2003，43:233 －260.

11 Moi P，Chan K，Asunis I，et al.Isolation of NF－E2－related factor 2(Nrf2)，a NF－E2－like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF－E2/AP1 repeat of the beta－globin locus control region ［J］ .Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(21):9926－9930.

12 Jain AK，Bloom DA，Jaiswal AK，et al.Nuclear import and export signal s in cont rol of Nrf2 ［J］ .J Biol Chem，2005，280(32):29158－29168.