吳 楓，孔令韜，湯艷清

抑郁癥是一種以情緒低落、思維遲緩、行為遲滯為主要表現(xiàn)的常見精神疾病，并伴有食欲減退和睡眠障礙等軀體癥狀，給患者本人、家庭、社會(huì)帶來了極大的危害和沉重的負(fù)擔(dān)［1］。但到目前為止，人們對(duì)抑郁癥的了解仍然很不完善，其病因、發(fā)病機(jī)制、治療等方面都存在巨大空白。應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)病的重要因素，近年來神經(jīng)生物學(xué)研究也表明，應(yīng)激事件等因素導(dǎo)致的大腦神經(jīng)元可塑性改變及神經(jīng)元功能受損可能是抑郁癥的重要發(fā)病機(jī)制之一。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (neurotrophins，NTs)家族的成員之一，NTs家族是調(diào)節(jié)神經(jīng)應(yīng)答的一個(gè)分泌蛋白質(zhì)家族，BDNF是NTs家族中表達(dá)最充分的一個(gè)，它不僅對(duì)神經(jīng)元的分化極為重要，而且對(duì)成年大腦神經(jīng)元的可塑性和存活具有重要意義。此外，當(dāng)面臨缺氧、缺血、接觸神經(jīng)毒物、應(yīng)激等可能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的情況時(shí)，BDNF還能提供神經(jīng)保護(hù)作用［2］。臨床研究表明，抑郁癥患者的血清BDNF水平下降，而抗抑郁治療能夠提高血清BDNF水平［3-5］，但在抑郁癥發(fā)病過程中，BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的地位和作用尚不清楚。海馬是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)之一，與抑郁癥的發(fā)病關(guān)系密切［6］，也是大腦內(nèi)BDNF表達(dá)的重要場(chǎng)所。國(guó)內(nèi)外研究均表明慢性應(yīng)激所致抑郁能導(dǎo)致海馬BDNF表達(dá)降低［7-8］，提示海馬BDNF表達(dá)減少可能在抑郁癥的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。本研究通過觀察兩種不同作用機(jī)制抗抑郁藥物氟西汀和碳酸鋰對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討B(tài)DNF在抑郁癥發(fā)病中的作用及抗抑郁藥物的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由飲食水，光暗周期為12 h/12 h，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。用隨機(jī)排列表法將大鼠分為4組:抑郁模型組、氟西汀組、碳酸鋰組和對(duì)照組，各15只。

1.1.2 主要試劑 兔抗大鼠BDNF抗體 (武漢博士德生物工程有限公司)，生物素標(biāo)記的山羊抗兔 IgG，ECL試劑盒(Santa Cruz Co.)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 第1～21天，對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng);抑郁模型組、氟西汀組和碳酸鋰組大鼠隨機(jī)接受7種不同的刺激:電擊足底 (30～40 V，20 s/次，間隔1 min，共20次)、強(qiáng)迫游泳 (水溫20℃，5 min)、夾尾 (1 min)、搖晃 (水平往復(fù)，1次/s，共15 min)、熱應(yīng)激 (45℃溫箱，5 min)、禁食 (48 h)、禁水 (24 h)。每天隨機(jī)給予一種刺激，每種刺激累計(jì)使用2 ～3次［7］。

1.2.2 行為學(xué)指標(biāo)觀察 制備模型前后，對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行開場(chǎng)法測(cè)定大鼠5 min內(nèi)的行為表現(xiàn)，包括水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)等。制備模型前后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行液體消耗實(shí)驗(yàn)，計(jì)算24 h內(nèi)蔗糖水消耗百分比 (糖水消耗/總液體消耗×100%)。

1.2.3 藥物干預(yù) 氟西汀片劑 (20 mg/片)、碳酸鋰片劑(250 mg/片)分別研磨成粉，溶于蒸餾水。第1～21天，每天應(yīng)激前，氟西汀組大鼠灌胃氟西汀10 mg/kg，碳酸鋰組大鼠灌胃碳酸鋰60 mg/kg，抑郁模型組和對(duì)照組大鼠灌胃等體積的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.4 腦組織處理及Western blot測(cè)定 第22天，將大鼠斷頭處死，迅速取腦剝離海馬組織，置于4℃環(huán)境中，加入300 μl裂解液勻漿并離心1 h，吸取上清液，進(jìn)行免疫印跡測(cè)定。具體步驟如下:考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白濃度后加入樣品緩沖液調(diào)節(jié)樣品蛋白濃度;灌膠，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液中4℃過夜;加入按1∶250比例稀釋的BDNF抗體，搖床上室溫孵育2 h;加入按1∶400稀釋的辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG，搖床上室溫孵育2 h;ECL法顯色;曝光，顯影，定影。Western blot結(jié)果用 Chemi Imager 5500 V2.03軟件掃描，再用Fluor Chen2.0軟件定量分析測(cè)得IDV值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 ()表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，對(duì)P＜0.05的指標(biāo)再用q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠慢性應(yīng)激前后行為學(xué)指標(biāo)的變化 慢性應(yīng)激前，4組大鼠的水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)和糖水消耗百分比間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。慢性應(yīng)激21 d后:抑郁模型組大鼠水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)、糖水消耗百分比均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.01);碳酸鋰組大鼠水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)和糖水消耗百分比均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05);氟西汀組大鼠水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)和糖水消耗百分比均顯著高于抑郁模型組 (P＜0.05)，水平穿越格數(shù)和豎立次數(shù)顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)，而修飾次數(shù)和糖水消耗百分比與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 慢性應(yīng)激前后4組大鼠開場(chǎng)行為及糖水消耗的比較 ()Table 1 Comparison of rat behaviors and sucrose consumption among four groups before and after stress stimulation

表1 慢性應(yīng)激前后4組大鼠開場(chǎng)行為及糖水消耗的比較 ()Table 1 Comparison of rat behaviors and sucrose consumption among four groups before and after stress stimulation

注: 與對(duì)照組比較，*P ＜0.01，▲P ＜0.05; 與抑郁模型組比較，△P ＜0.05

組別 只數(shù)應(yīng)激前水平穿越格數(shù) 豎立次數(shù) 修飾次數(shù) 糖水消耗百分比 (%)應(yīng)激后水平穿越格數(shù) 豎立次數(shù) 修飾次數(shù) 糖水消耗百分比 (%)對(duì)照組 15 37.9 ±10.9 22.6 ±8.2 7.2 ±3.3 70.1 ±8.7 46.0 ±18.9 20.3 ±11.3 8.4 ±2.7 68.5 ± 8.2抑郁模型組 15 35.3 ±13.8 23.8 ±5.8 8.8 ±3.9 70.4 ±6.9 23.2 ±23.0* 8.1 ± 7.2* 3.6 ±3.5* 55.4 ±11.7*碳酸鋰組 15 38.5 ±13.1 22.0 ±8.1 8.3 ±6.0 73.0 ±6.0 26.7 ±18.3▲ 9.2 ± 5.5* 4.3 ±2.6* 60.2 ± 7.9▲氟西汀組 15 35.6 ±13.6 24.0 ±7.4 10.0 ±4.8 72.6 ±9.1 39.1 ±17.8▲△ 13.4 ± 5.0▲△ 6.9 ±2.4△ 66.0 ± 7.3△F 0.236 0.259 0.986 0.557 4.380 7.770 9.182 6.569 P 值 0.871 0.854 0.406 0.646 0.008 0.000 0.000 0.001值

2.2 免疫印跡法測(cè)定海馬BDNF表達(dá) 慢性應(yīng)激后4組大鼠海馬BDNF表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);其中抑郁模型組大鼠海馬BDNF表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組 (P＜0.01);碳酸鋰組大鼠海馬BDNF表達(dá)水平顯著高于抑郁模型組 (P＜0.01)，但仍顯著低于對(duì)照組 (P＜0.01);氟西汀組大鼠海馬BDNF表達(dá)水平顯著高于抑郁模型組 (P＜0.01)，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表2)。

表2 免疫印跡法檢測(cè)4組大鼠海馬BDNF表達(dá)的比較 ()Table 2 Comparison of BDNF expression levels in hippocampus of rats in four groups by Western blotting method

表2 免疫印跡法檢測(cè)4組大鼠海馬BDNF表達(dá)的比較 ()Table 2 Comparison of BDNF expression levels in hippocampus of rats in four groups by Western blotting method

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與抑郁模型組比較，△P＜0.01

組別 只數(shù) BDNF的表達(dá)水平 (IDV值)對(duì)照組 15 35 437±2 096抑郁模型組 15 22 796±7 392*碳酸鋰組 15 29 761±3 125＊△氟西汀組 15 32 659±3 359△F 值0.000 22.090 P值

3 討論

慢性不可預(yù)見性應(yīng)激 (CUMS)抑郁模型［9］采用輕度、不可預(yù)見的應(yīng)激因子模擬人類生活事件和環(huán)境應(yīng)激刺激等心理社會(huì)因素，其理論依據(jù)與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激原促進(jìn)疾病發(fā)生、加速疾病發(fā)展的機(jī)制更接近，是近年來國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的探討抑郁癥發(fā)病機(jī)制及抗抑郁藥物的藥理學(xué)研究的動(dòng)物模型之一。本研究中，抑郁模型組大鼠經(jīng)過21 d的慢性綜合應(yīng)激，與對(duì)照組大鼠相比活動(dòng)能力降低、探究行為減少、修飾次數(shù)減少以及糖水消耗百分比下降，這些表現(xiàn)與臨床抑郁癥患者所表現(xiàn)的精神運(yùn)動(dòng)改變、興趣或快感的喪失有很大程度的相似性，說明本研究中大鼠抑郁癥模型的制作是成功的［7］。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過21 d的慢性綜合應(yīng)激，抑郁模型組大鼠海馬BDNF表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，這提示抑郁癥的發(fā)病可能與BDNF表達(dá)降低有關(guān)。海馬是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)，也是大腦具有可塑性和極易受損的一個(gè)腦區(qū)，因而在對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究中備受關(guān)注。研究表明，慢性應(yīng)激可導(dǎo)致海馬出現(xiàn)體積減小、細(xì)胞數(shù)目減少、細(xì)胞萎縮及增生抑制等多種神經(jīng)元可塑性受損的表現(xiàn)，同時(shí)伴有學(xué)習(xí)、記憶和情緒反應(yīng)的缺陷［10］。大腦內(nèi)的BDNF主要由海馬和大腦皮質(zhì)合成，在對(duì)正常神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)及損傷神經(jīng)元的再生和功能重建方面發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果中慢性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠海馬BDNF表達(dá)明顯減低，這與國(guó)外類似研究結(jié)果是一致的［11-12］，說明慢性應(yīng)激導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元可塑性和功能受損可能與海馬BDNF表達(dá)降低有關(guān)，應(yīng)激導(dǎo)致的大腦內(nèi)BDNF水平下降可能是抑郁癥發(fā)病的內(nèi)在病理生理機(jī)制之一。但也有研究得出了相反的結(jié)論［13］，這可能與不同研究采用的動(dòng)物模型和應(yīng)激強(qiáng)度的差異有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)氟西汀組和碳酸鋰組大鼠在經(jīng)過21 d的慢性綜合應(yīng)激后，其行為學(xué)表現(xiàn)好于抑郁模型組大鼠，說明這兩種藥物都能改善抑郁行為，而且氟西汀的效果要好于碳酸鋰;氟西汀組和碳酸鋰組大鼠海馬BDNF表達(dá)均顯著高于抑郁模型組，氟西汀組的BDNF表達(dá)與對(duì)照組無顯著差異，但碳酸鋰組則顯著低于對(duì)照組。氟西汀是5-羥色胺再攝取抑制劑 (serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)類抗抑郁藥物的代表藥物，是目前臨床上治療抑郁癥的一線藥物之一，具有良好的抗抑郁作用。以往SSRIs類藥物被認(rèn)為主要是通過調(diào)整突觸間隙5-羥色胺的濃度來起到抗抑郁作用，但近年來人們發(fā)現(xiàn)，包括氟西汀在內(nèi)的SSRIs能夠逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激導(dǎo)致的BDNF的mRNA表達(dá)水平下降［13-14］，這與本研究結(jié)果是一致的。碳酸鋰作為最早應(yīng)用于臨床治療的情感穩(wěn)定劑，是治療急性雙相抑郁障礙的一線藥物，同時(shí)也被作為抗抑郁藥物的增效劑用于單相抑郁發(fā)作的治療，能夠增強(qiáng)抗抑郁藥物的治療效果。有研究報(bào)道碳酸鋰能增加大鼠海馬BDNF水平［15］，但另外的研究則不支持這一結(jié)論［16］。本研究結(jié)果顯示，碳酸鋰能夠上調(diào)大鼠海馬BDNF表達(dá)水平，但效果弱于氟西汀，也無法使其回到正常水平，這一結(jié)果一方面說明其抗抑郁療效的有限性，同時(shí)也提示其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。綜合本研究結(jié)果，我們推測(cè)抗抑郁藥物通過上調(diào)海馬BDNF的表達(dá)，增強(qiáng)BDNF對(duì)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)作用，可能是抗抑郁藥物發(fā)揮療效的重要中間環(huán)節(jié)。

綜上所述，慢性應(yīng)激導(dǎo)致海馬BDNF水平的變化可能是抑郁癥發(fā)病的內(nèi)在病理生理機(jī)制，抗抑郁藥物對(duì)BDNF水平的調(diào)控可能是其發(fā)揮抗抑郁療效的靶點(diǎn)之一，故提高腦內(nèi)BDNF水平以增強(qiáng)對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)也可能對(duì)抑郁癥的治療起到積極效果。不同種類的抗抑郁藥物療效不同，他們的作用機(jī)制也有差異，聯(lián)合應(yīng)用多種不同機(jī)制的抗抑郁藥物治療是否能夠通過他們各自作用機(jī)制的特異性影響起到聯(lián)合增效作用將是下一步的研究方向。

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