薄冰常蕓

1上海體育學(xué)院（上海200438）

2國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所

心臟規(guī)律的電學(xué)活動(dòng)依賴于竇房結(jié)功能的正常，其中竇房結(jié)細(xì)胞以舒張期緩慢自動(dòng)除極為特征，這是竇房結(jié)細(xì)胞形成自發(fā)起搏活動(dòng)的電學(xué)基礎(chǔ)［1］，同時(shí)也是建立在起搏細(xì)胞膜上多種離子通道共同活動(dòng)的基礎(chǔ)之上。在參與起搏活動(dòng)產(chǎn)生及調(diào)節(jié)的多種機(jī)制中，ATP-敏感型K+通道（KATP通道）在多種病理生理?xiàng)l件下發(fā)揮著重要作用［2］。1996年，Han等［3］在兔竇房結(jié)細(xì)胞中觀察到KATP通道的存在，該通道可在細(xì)胞ATP含量下降時(shí)開放。KATP通道是由內(nèi)向整流K+通道（Kir）和ATP結(jié)合蛋白（ABP）兩部分組成，前者形成離子通道，后者決定KATP的功能，參與組成KATP的Kir6.x為Kir6.1和Kir6.2。研究表明，在缺血缺氧或代謝抑制狀態(tài)下，心肌細(xì)胞KATP通道開放可縮短動(dòng)作電位時(shí)程，并可引發(fā)折返激動(dòng)等致心律失常效應(yīng)［4］，竇房結(jié)KATP通道的激活可降低自發(fā)起搏活動(dòng)速率進(jìn)而減慢心率并保護(hù)心肌細(xì)胞，但這一效應(yīng)有可能引發(fā)竇房結(jié)功能障礙［3］。臨床醫(yī)學(xué)對(duì)于上述問(wèn)題進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞KATP通道的影響卻未見報(bào)道，因此，本研究即以KATP通道亞基mRNA表達(dá)及通道電流密度為切入點(diǎn)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、細(xì)胞急性分離及全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠竇房結(jié)細(xì)胞膜上KATP通道的影響，為進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)性竇房結(jié)功能障礙及運(yùn)動(dòng)性心律失常提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康雄性SD大鼠180只，8周齡，體重（220±8）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK（京）2011-0001。動(dòng)物隨機(jī)分為9組，每組20只，包括安靜對(duì)照組（C組）1組、一次力竭組（O組）4組、反復(fù)力竭組（R組）4組，運(yùn)動(dòng)組大鼠分別于運(yùn)動(dòng)后即刻、4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)不同時(shí)相取材，一次力竭運(yùn)動(dòng)各組大鼠分別以O(shè)-0h、O-4h、O-12h、O-24h命名，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)各組大鼠分別以R-0h、R-4h、R-12h、R-24h命名。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（18±2）℃，光照時(shí)間12小時(shí)，相對(duì)濕度為40%～ 50%。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，動(dòng)物使用許可證號(hào)0011-0030。本實(shí)驗(yàn)在國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 運(yùn)動(dòng)模型建立和取材

安靜對(duì)照組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)入動(dòng)物房后首先適應(yīng)3天，然后進(jìn)行2天適應(yīng)性游泳運(yùn)動(dòng) （20分鐘/次）。反復(fù)力竭各組大鼠尾部負(fù)重約3%體重，每天進(jìn)行1次力竭游泳，每次運(yùn)動(dòng)時(shí)間約2小時(shí)，每周6天，共2周。每次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，用干毛巾迅速擦干大鼠身上水分，用電吹風(fēng)把毛吹干后，放回籠中休息，并分別在最后一次力竭游泳后即刻、4 h、12 h、24 h取材。一次力竭運(yùn)動(dòng)各組正常喂養(yǎng)2周后，進(jìn)行一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)，尾部負(fù)重約3%體重，并分別在力竭運(yùn)動(dòng)后即刻、4 h、12 h、24 h取材。力竭標(biāo)準(zhǔn)參照Thomas［5］的報(bào)道，即10 s后動(dòng)物仍不能返回水面，并且撈出后置于平面不能完成翻正反射。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

1.3.1.1 大鼠心臟竇房結(jié)組織取材

使用10%水合氯醛（1 ml/100g體重）腹腔注射麻醉，待大鼠結(jié)膜反射、翻正反射消失后，仰臥固定，75%酒精消毒胸腹部皮膚。打開胸腔后，游離出上腔靜脈，沿離心方向約0.5 cm處剪斷；沿著界溝行切口打開右心房進(jìn)入腔靜脈，由靠近并平行于界嵴的腔靜脈區(qū)域分離出一條形組織，其中含有主要起搏細(xì)胞。

1.3.1.2 大鼠心臟竇房結(jié)總RNA提取

采用TRIzol法提取心臟竇房結(jié)總RNA。將收集管中的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到含有 1 ml TRIzol-Reagent的EP管中，顛倒混勻，室溫靜置5～10 min，加入200 μl氯仿，手動(dòng)劇烈震蕩混勻15 s，室溫靜置2～3 min，4℃，12000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)上層水相（500～600 μl）于另一新1.5 ml EP管中，加等體積異丙醇（500～600 μl）混勻，室溫放置30 min。棄上清，加DEPC水溶液溶解，-80℃保存。

1.3.1.3 逆轉(zhuǎn)錄RNA合成為cDNA

根據(jù)樣品數(shù)量按下列反應(yīng)體系配制反應(yīng)混合液，引物Oligo（dT），10 pmol/μl（2 μl）、10 mM dNTP mix（4 μl）、H2O（24 μl）共30 μl。將混合液分裝到0.2 ml PCR管中，分別加入2 μl RNA（2 μg左右），70℃變性5 min，冰上速冷2 min，離心將溶液收集至管底。按順序根據(jù)下列反應(yīng)體系配置混合反應(yīng)液：5× PCR buffer（10 μl）、DTT（6 μl）、M-MLV RT（酶）（MMLV-Promega）（2 μl），共18 μl。將上述混合物分裝到上述0.2 ml PCR管中，共計(jì)50 μl體系。42℃延伸50 min，95℃保溫5 min終止反應(yīng)。cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)搜索Genbank查找基因序列，應(yīng)用Primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其特異性，所有引物擴(kuò)增目的基因片斷長(zhǎng)度均小于150 bp。設(shè)計(jì)的引物由Invitrigin公司合成。引物序列如表1所示：

表1 Real-time PCR基因引物序列

1.3.1.5 SYBR GREEN熒光定量PCR

將cDNA和引物解凍，取定量PCR用的96孔板，按如下成分加入：Real qPCR Master Mix（12 μl）、引物F/R（上下游引物終濃度均為10 pmol/μl）（0.5/ 0.5 μl）、H2O（11 μl）。最后加入相對(duì)應(yīng)的cDNA（1 μl），共25 μl，封膜。打開ABI7900HT定量PCR儀，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件如下：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min（生成擴(kuò)增曲線）；95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s（生成溶解曲線），上述反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)。

1.3.1.6 mRNA結(jié)果分析

觀察溶解曲線，判斷PCR特異性；以2-△△Ct作為計(jì)算公式，分析各組間mRNA的表達(dá)差異，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件及EXCEL軟件中單因素方差分析（ANOVA），各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的顯著性差異采用SNK法，P<0.05為顯著性差異，P< 0.01為非常顯著性差異。

1.3.2 大鼠竇房結(jié)細(xì)胞膜KATP通道電流密度測(cè)定

1.3.2.1 大鼠竇房結(jié)細(xì)胞急性分離

參考既往文獻(xiàn)［6，7］，將分離后的心臟行主動(dòng)脈逆行插管，固定后懸掛于Langendorff灌流裝置上以普通Tyrode液灌流3～5 min，灌流速度7 ml/min，靜水壓70 cm H2O，溫度37℃。待心腔內(nèi)殘血全部流出后，將普通Tyrode液換成無(wú)Ca2+-Tyrode液以消除自發(fā)節(jié)律。心臟由灌流裝置取下，在無(wú)Ca2+-Tyrode液中沿著界溝行切口打開右心房進(jìn)入腔靜脈，由靠近并平行于界嵴的腔靜脈區(qū)域分離出一條形組織，其中含有主要起搏細(xì)胞。

分離的竇房結(jié)組織置于2 ml離心管中，管中充滿2 ml含有0.85 mg/ml Collagenase II、0.4 mg/ml E-lastase type II-A和13.5 μl/ml Protease（1 mg/100μl）的無(wú)Ca2+-Tyrode液，并置于37℃水浴20～23 min。最后，條形組織轉(zhuǎn)移至含有KB液的培養(yǎng)皿中，KB液更新3次以去除酶液。用尖端直徑2 mm的玻璃吸管輕柔吹打KB液7～9 min，使用200目微孔不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾去除結(jié)締組織和未消化細(xì)胞，濾液于室溫下靜置30 min以備用。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度在18～28℃之間，實(shí)驗(yàn)所有灌流液均用醫(yī)用飽和純氧并在灌流過(guò)程中持續(xù)通氧。

1.3.2.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄大鼠竇房結(jié)KATP通道電流密度

取出完成貼壁的竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于倒置顯微鏡下，用氧飽和的電極外液灌流，灌流速度約1 ml/min，沖去死亡細(xì)胞碎片。選取處于靜息狀態(tài)下的表面光滑、橫紋清晰、折光好、立體感強(qiáng)的單個(gè)竇房結(jié)細(xì)胞為研究對(duì)象。本研究采用硅酸鹽硬質(zhì)玻璃制作記錄電極 （武漢華中科大儀博生命科學(xué)儀器有限公司），經(jīng)P-97（Sutter美國(guó)）水平拉制儀兩步拉制而成。電極充灌電極液后電阻為2.5～3.5 MΩ。將玻璃微電極安置于膜片鉗放大器（HEKA EPC10德國(guó)）前端探頭夾持器上，然后緩慢調(diào)節(jié)微操儀推動(dòng)電極尖端接觸到細(xì)胞膜，當(dāng)電阻值達(dá)到1～2 GΩ時(shí)即形成高阻封接，此時(shí)補(bǔ)償快電容，然后采用脈沖式負(fù)壓吸引，將封接吸入電極尖端內(nèi)的細(xì)胞膜片吸破，即“破膜”，使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相溝通，形成全細(xì)胞記錄狀態(tài)，示波器上顯示跨細(xì)胞膜電容電流，隨后進(jìn)行慢電容補(bǔ)償 （C-Slow Capacitance compensation），并記錄細(xì)胞膜電容值。實(shí)驗(yàn)刺激信號(hào)由pulse+pulsefit8.6軟件控制，通過(guò)Ag-AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生的電流信號(hào)經(jīng)EPC10放大、濾波，所記錄的原始數(shù)據(jù)圖像被存入計(jì)算機(jī)硬盤。在pulse8.6應(yīng)用程序中可打開原始數(shù)據(jù)文件，找出各道指令電壓下的電流圖，測(cè)定其電流值。實(shí)驗(yàn)溫度為室溫18～28℃。

在電極外液中加入0.3 mmol/L CdCl2以阻斷ICa，L，1 mmol/L BaCl2以阻斷IK1通道，當(dāng)形成全細(xì)胞封接后，給予細(xì)胞保持電位-40 mV，以10 mV步階，-100 mV～100 mV、300 ms的階梯刺激方波，然后復(fù)極至-40 mV，記錄IK，ATP電流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定-90 mV～+70 mV各條件電壓下 IK，ATP穩(wěn)態(tài)電流值與鉗制電位-40 mV時(shí)的差值作為IK，ATP電流值。

1.3.2.3 溶液配制

正常臺(tái)氏液（mmol/L）：NaCl 140，KCl 5.4，HEPES 10，MgCl21，CaCl22，Glucose 10，（pH7.4 NaOH）；無(wú)鈣臺(tái)氏液 （mmol/L）：NaCL 140，KCL 5.4，HEPES 10，MgCl21，Glucose 10，（pH7.4 NaOH）；KB 液（mmol/L）：L-谷氨酸 120，KOH 80，EGTA 0.3，KCl 20，HEPES 10，MgCl21，Glucose 10，（pH7.4 KOH）。消化酶液 （mmol/L）：5 ml無(wú)鈣臺(tái)氏液中加入0.85 mg/ml CollagenaseⅡ、0.4 mg/ml Elastase type II-A和13.5 μl/ml Protease（1 mg/100μl）；KATP通道電極內(nèi)液（mmol/L）：K-aspartate 110，KCl 20，MgCl21，Na2ATP 5，Na-GTP 0.1，HEPES 10，Na-phosphocreatine 5，EGTA 5，（pH7.3 KOH），0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后分裝于1 ml EP管，-20℃冰箱儲(chǔ)存；KATP通道電極外液（mmol/L）：NaCl 140；KCl 5.4，HEPES 10，MgCl21，CaCl21，Glucose 10，（pH7.4 NaOH）。CollagenaseⅡ購(gòu)于Worshington Biochemical公司，EGTA、HEPES、L-谷氨酸、Na2ATP、Na-GTP、Elastase type II-A及Protease均購(gòu)于Sigma公司，其它試劑為化學(xué)分析純。

1.3.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果以通道電流密度數(shù)值表示，電流密度為電流強(qiáng)度與膜電容的比值（pA/pF），其中電流強(qiáng)度為實(shí)驗(yàn)所測(cè)量電流峰值，膜電容為實(shí)驗(yàn)中記錄到的單個(gè)細(xì)胞電容值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各通道電流密度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件及EXCEL軟件中單因素方差分析（ANOVA），各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的顯著性差異采用SNK法，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠竇房結(jié)KATP通道亞基mRNA表達(dá)

圖1 瓊脂糖凝膠電泳

如圖1、表2所示，與對(duì)照組相比，一次力竭各組Kir6.2 mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；反復(fù)力竭組R-0h組、R-4h組、R-12h組Kir6.2 mRNA表達(dá)明顯增加 （P<0.01，P<0.01，P<0.01），隨著取材時(shí)間的延長(zhǎng)，Kir6.2 mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但R-24h組仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。與一次力竭 O-0h組相比，反復(fù)力竭組 R-0h、R-4h組Kir6.2 mRNA表達(dá)增加（P<0.05，P<0.05）。

2.2 各組大鼠竇房結(jié)KATP通道電流密度

如圖2、圖3及表3所示，與對(duì)照組相比，一次力竭運(yùn)動(dòng)可引起大鼠竇房結(jié)KATP通道IK，ATP電流密度增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；反復(fù)力竭各時(shí)相組IK，ATP電流密度顯著增加 （P<0.01）。與一次力竭O-0h組相比，反復(fù)力竭各時(shí)相組IK，ATP電流密度顯著增加（P<0.01）。反復(fù)力竭組中隨著取材時(shí)間的延長(zhǎng)，電流密度呈下降趨勢(shì)，但24h內(nèi)仍未達(dá)到對(duì)照組水平。

表2 各組大鼠竇房結(jié)KATP通道亞基Kir6.2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（2-△△Ct）

圖2 對(duì)照組（A）和反復(fù)力竭即刻組（B）大鼠竇房結(jié)細(xì)胞IK，ATP原始電流圖

圖3 對(duì)照組、一次力竭即刻組和反復(fù)力竭即刻組大鼠竇房結(jié)細(xì)胞膜上KATP通道IK，ATPI-V曲線

表3 各組大鼠竇房結(jié)細(xì)胞KATP通道電流密度（pA/pF）

3 討論

KATP通道在竇房結(jié)細(xì)胞缺血缺氧或代謝抑制狀態(tài)下開放并引導(dǎo)具有內(nèi)向整流特性的K+電流，該電流可引起竇房結(jié)細(xì)胞膜最大舒張電位超級(jí)化及起搏活動(dòng)減慢等致心律失常效應(yīng)［8］。本研究通過(guò)建立兩周力竭游泳模型探討大鼠竇房結(jié)KATP通道亞基Kir6.2 mRNA表達(dá)及通道IK，ATP電流密度的變化，結(jié)果表明，兩周力竭運(yùn)動(dòng)可引起竇房結(jié)細(xì)胞膜Kir6.2 mRNA表達(dá)及IK，ATP電流密度增加，可見，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞KATP通道結(jié)構(gòu)組成及功能表現(xiàn)均產(chǎn)生明顯的影響。

Kir6.2基因作為KATP通道亞基的主要組成部分在該通道的功能活動(dòng)中具有重要作用。Saegusa等［9］在小鼠竇房結(jié)細(xì)胞中觀察到K+通道開放劑吡那地爾引導(dǎo)外向電流密度明顯低于心室細(xì)胞和心房細(xì)胞。Marionneau等［10］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠竇房結(jié)中Kir6.2和SUR2的mRNA表達(dá)明顯低于心房和心室肌。Bao等［11］的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明小鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)Kir6.2基因表達(dá)明顯低于心室肌。Fukuzaki等［12］成功地建立Kir6.2基因敲除小鼠模型并用來(lái)觀察該基因在竇房結(jié)組織缺氧和代謝抑制條件下的作用。100 μM吡那地爾可引起野生型小鼠0 mV穩(wěn)定狀態(tài)下外向電流增加約15%。在野生型小鼠竇房結(jié)細(xì)胞中，代謝抑制2 min可增加外向電流約30%，并減少ICa，L30%～40%，而Kir6.2基因敲除小鼠則未出現(xiàn)變化。由此可見，Kir6.2基因表達(dá)與KATP通道電流變化密切相關(guān)。本研究在大鼠反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)模型中觀察到Kir6.2 mRNA表達(dá)增加，隨著取材時(shí)間的延長(zhǎng)，Kir6.2 mRNA表達(dá)下降，但在24小時(shí)內(nèi)仍明顯高于對(duì)照組及一次力竭各組，這可能會(huì)引起KATP通道電流的改變，而對(duì)于IK，ATP電流密度的測(cè)量也驗(yàn)證了這一推測(cè)，對(duì)照組IK，ATP電流密度為（1.02±0.07）pA/pF，一次力竭組該電流密度即出現(xiàn)增加，反復(fù)力竭組則上升至 （3.77±0.05）pA/ pF，明顯高于對(duì)照組及一次力竭組，可見，Kir6.2 mRNA表達(dá)與IK，ATP電流的變化具有相似的趨勢(shì)。

上述由反復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)KATP通道出現(xiàn)的變化可能對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中竇房結(jié)功能活動(dòng)產(chǎn)生影響。研究表明，心室肌細(xì)胞膜上KATP通道參與運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的缺血再灌注保護(hù)機(jī)制，缺血缺氧等病理狀態(tài)下KATP通道的開放可加速動(dòng)作電位Ⅲ期復(fù)極并減慢動(dòng)作電位時(shí)程，通過(guò)減少Ca2+內(nèi)流降低ATP消耗，從而使細(xì)胞在代謝抑制期間得到保護(hù)［13，14］。對(duì)于竇房結(jié)細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，50 μM吡那地爾可引起兔竇房結(jié)細(xì)胞超級(jí)化，最大舒張電位降低約10 mV，并減慢自發(fā)起搏速率［3］。野生型小鼠中，吡那地爾通過(guò)減少舒張期去極化延長(zhǎng)竇房結(jié)細(xì)胞周期從而減少竇房結(jié)細(xì)胞的自發(fā)活動(dòng)。Fukuzaki等［12］使用缺氧無(wú)葡萄糖溶液進(jìn)行Langendroff灌流5 min后發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠竇性周期長(zhǎng)度從（207±10）ms延長(zhǎng)至（613±84）ms，Kir6.2基因敲除小鼠竇性周期長(zhǎng)度增加幅度偏小，從 （198± 17）ms延長(zhǎng)至（265±32）ms。吡那地爾能夠激活野生型小鼠竇房結(jié)細(xì)胞中格列本脲敏感型外向電流，當(dāng)劑量達(dá)到100 μM時(shí)，可使竇性周期長(zhǎng)度由 （410± 56）ms延長(zhǎng)至 （605±108）ms，舒張期去極化速率下降，但在Kir6.2基因敲除小鼠中卻未觀察到這一作用。在應(yīng)用2,4-二硝基苯酚模擬代謝抑制條件時(shí)，野生型小鼠竇性周期長(zhǎng)度從（292±38）ms延長(zhǎng)至（585± 91）ms，這一現(xiàn)象在Kir6.2基因敲除小鼠竇房結(jié)細(xì)胞中也未出現(xiàn)，但野生型小鼠竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的其它參數(shù)如動(dòng)作電位時(shí)程 （APD）和最大舒張電位（MDP）等并未發(fā)生改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠中，反映竇房結(jié)自律性的右心房心電圖在復(fù)氧后恢復(fù)正常，而Kir6.2基因敲除小鼠未恢復(fù)［12］，這提示缺氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i的增加可能影響Kir6.2基因敲除小鼠竇房結(jié)功能的恢復(fù)。在野生型小鼠竇房結(jié)細(xì)胞中，代謝抑制通過(guò)降低舒張期去極化斜率（SDD）減慢自發(fā)活動(dòng)，而在Kir6.2基因敲除小鼠中，竇房結(jié)細(xì)胞沒有引起明顯的SDD改變，只出現(xiàn)MDP的輕度下降，出現(xiàn)這一變化的原因可能是野生型小鼠KATP通道激活并有效促使Ca2+由Na+-Ca2+交換體流出以維持MDP。細(xì)胞膜KATP通道的激活可以防止缺氧后復(fù)氧所導(dǎo)致的Ca2+超載并提高缺氧后心臟功能［15，16］。Suzuki等［17］研究表明，細(xì)胞膜KATP通道對(duì)于保護(hù)缺血心肌細(xì)胞有重要作用［12］。Dhein［18］還發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下，［Ca2+］i的增加可引起細(xì)胞間縫隙連接的傳導(dǎo)異常。因此，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)引起竇房結(jié)細(xì)胞IK，ATP電流密度增加可能引起Ca2+內(nèi)流的減少?gòu)亩档图?xì)胞能量消耗，對(duì)于竇房結(jié)細(xì)胞起搏活動(dòng)和傳導(dǎo)功能的維持具有保護(hù)作用［19］，但這一效應(yīng)可能引起SDD下降及APD延長(zhǎng)，導(dǎo)致竇房結(jié)細(xì)胞自發(fā)起搏活動(dòng)效率的下降，進(jìn)而引起竇房結(jié)功能障礙及運(yùn)動(dòng)性心律失常的出現(xiàn)。

分析反復(fù)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起Kir6.2 mRNA表達(dá)與IK，ATP電流增加的原因，可能與運(yùn)動(dòng)心臟重塑有關(guān)。竇房結(jié)內(nèi)細(xì)胞具有能量代謝低的特點(diǎn)，這是竇房結(jié)在缺血缺氧、代謝抑制等非生理?xiàng)l件下維持心臟正常節(jié)律的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。然而，長(zhǎng)時(shí)間、高強(qiáng)度的反復(fù)訓(xùn)練仍會(huì)造成竇房結(jié)細(xì)胞和組織的損傷性改變。朱永澤等［20］進(jìn)行的組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運(yùn)動(dòng)即可造成竇房結(jié)內(nèi)的P細(xì)胞和T細(xì)胞發(fā)生損傷性改變，1周反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)則可引起竇房結(jié)細(xì)胞內(nèi)線粒體彌漫性增生、大量凋亡細(xì)胞散在分布、起搏細(xì)胞間連接混亂等超微結(jié)構(gòu)改變，上述細(xì)胞的缺血缺氧性改變有可能導(dǎo)致Kir6.2 mRNA表達(dá)與IK，ATP電流密度增加。盡管反復(fù)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起KATP通道活動(dòng)增加可對(duì)運(yùn)動(dòng)心臟在缺氧或代謝抑制時(shí)產(chǎn)生保護(hù)作用，但經(jīng)由KATP通道外流K+的增加可引起細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的改變［21］，引發(fā)竇房結(jié)自律活動(dòng)減少并導(dǎo)致竇性停搏、異位起搏點(diǎn)出現(xiàn)等惡性心律失常的發(fā)生［22］，以及心輸出量減少所導(dǎo)致的心、腦、腎等器官無(wú)法滿足機(jī)體運(yùn)動(dòng)過(guò)程中需求這類猝死危險(xiǎn)因素的增加。這提示，長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致細(xì)胞膜KATP通道的活化可能在缺氧和代謝抑制時(shí)成為竇房結(jié)自律活動(dòng)減慢和竇性停搏的原因之一，因此，力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的KATP通道結(jié)構(gòu)和功能變化也成為竇房結(jié)自我保護(hù)及功能障礙的離子通道機(jī)制之一。

4 總結(jié)

反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)可引起竇房結(jié)細(xì)胞膜KATP通道亞基Kir6.2 mRNA表達(dá)及IK，ATP電流密度增加，這可能引起竇房結(jié)細(xì)胞舒張期自動(dòng)除極及自律活動(dòng)減慢，提示反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)于KATP通道的影響可能成為運(yùn)動(dòng)引發(fā)竇房結(jié)功能障礙及運(yùn)動(dòng)性心律失常的離子通道機(jī)制之一。

［1］DiFrancesco D.Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol，1993，55：455-472.

［2］Terzic A，Alekseev AE，Yamada S，et al.Advances in cardiac ATP-sensitive K+channelopathies from molecules to populations.Circ Arrhythm Electrophysiol，2011，4（4）：577-585.

［3］Han X，Light PE，Giles WR，et al.Identification and properties of an ATP-sensitive K+current in rabbit sino-atrial node pacemaker cells.J Physiol，1996，490：337-350.

［4］Flagg TP，Nichols CG.“Cardiac KATP”：a family of ion channels.Circ Arrhythm Electrophysiol，2011，4（6）：796-798.

［5］Thomas DP，Marshall KI.Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures.Int J Sports Med，1988，9（4）：257-260.

［6］Rose RA，Lomax AE，Kondo CS，et al.Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node：a role for the NPR-C receptor.Am J Physiol-Heart C，2004，286（5）：H1970-H1977.

［7］Cho HS，Takano M，Noma A.The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node.J Physiol，2003，550（1）：169-180.

［8］Baczko I，Husti Z，Lang V，et al.Sarcolemmal KATPchannel modulators and cardiac arrhythmias.Curr Med Chem，2011，18（24）：3640-3661.

［9］Saegusa N，Sato T，Tamagawa M，et al.Kir6.2-deficient mice are susceptible to stimulated ANP secretion：K(ATP) channel acts as a negative feedback mechanism?Cardiovasc Res，2005，67（1）：60-68.

［10］Marionneau C，Couette B，Liu J，et al.Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart.J Physiol，2005，562（1）：223-234.

［11］Bao L，Kefaloyianni E，Lader J，et al.Unique properties of the ATP-sensitive K+channel in the mouse ventricular cardiac conduction system.Circ Arrhythm Electrophysiol，2012，4（6）：926-935.

［12］Fukuzaki K，Sato T，Miki T，et al.Role of sarcolemmal ATP-sensitive K+channels in the regulation of sinoatrial node automaticity：an evaluation using Kir6.2-deficient mice.J Physiol，2008，586（11）：2767-2778.

［13］Zhu Z，Burnett CM，Maksymov G，et al.Reduction in number of sarcolemmal KATPchannels slows cardiac action potential duration shortening under hypoxia.Biochem Bioph Res Co，2011，415（4）：637-641.

［14］Golbidi S，Laher I.Exercise and the cardiovascular system. Cardiol Res Pract，2012，2012：1-15.

［15］Baczko I，Giles WR，Light PE.Pharmacological activation of plasma-membrane KATP channels reduces reoxygenation-induced Ca2+overload in cardiac myocytes via modulation of the diastolic membrane potential.Brit J Pharmacol，2004，141（6）：1059-1067.

［16］Baczko I，Jones L，McGuigan CF，et al.Plasma membrane KATPchannel-mediated cardioprotection involves posthypoxic reductions in calcium overload and contractile dysfunction：mechanistic insights into cardioplegia.FASEB J，2005，19（8）：980-982.

［17］Suzuki M，Sasaki N，Miki T，et al.Role of sarcolemmal K (ATP)channels in cardioprotection against ischemia/reperfusion injury in mice.J Clin Invest，2002，109（4）：509-516.

［18］Dhein S.Gap junction channels in the cardiovascular system：pharmacological and physiological modulation.Trends Pharmacol Sci，1998，19（6）：229-241.

［19］Quindry JC，Miller L，McGinnis G，et al.Ischemia reperfusion injury，KATPchannels，and exercise-induced cardioprotection against apoptosis.J Appl Physiol，2012，113（3）：498-506.

［20］朱永澤，吳庚華，王鑫，等.力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心臟竇房結(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2007，26（1）：86-89.

［21］Giudicessi JR，Ackerman MJ.Potassium-channel mutations and cardiac arrhythmias-diagnosis and therapy.Nat Rev Cardiol，2012，9（6）：319-332.

［22］Ravens U，Cerbai E.Role of potassium currents in cardiac arrhythmias.Europace，2008，10（10）：1133-1137.