吳超偉 韋杏泉 覃 良 李春籬

1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022;2.廣西柳州市古嶺酒廠，廣西 柳州 545107; 3.廣西產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，廣西 南寧 530022

目前人們由于生活節(jié)奏快，長(zhǎng)期缺少體育鍛煉，易疲勞和免疫力低下的亞健康人群有很多。針對(duì)以上人群，我們從扶正固本，調(diào)節(jié)臟腑功能入手，綜合調(diào)整機(jī)體臟腑功能，使精、氣、血液生有源，行有力的傳統(tǒng)中醫(yī)藥養(yǎng)生保健理論，自主研制了古嶺龍保健酒。是根據(jù)傳統(tǒng)中藥組方，結(jié)合現(xiàn)代新工藝研究制作的一種藥酒，酒體黃色澄明透亮，香味濃郁，醇厚柔和，回味綿長(zhǎng)。本品主要成分是絞股藍(lán)、西洋參、黨參、大棗、枸杞子、淫羊藿、黃精、龍眼肉、羅漢果等中藥，具有調(diào)補(bǔ)肝腎，滋脾養(yǎng)肺，補(bǔ)氣養(yǎng)血，扶正祛邪等免疫增強(qiáng)和緩解體力疲勞的保健作用。長(zhǎng)期使用的實(shí)踐結(jié)果表明，古嶺龍酒具有增強(qiáng)免疫功能和抗疲勞等藥理作用，且無(wú)任何毒副作用的特點(diǎn)。為了評(píng)價(jià)其飲用的安全性，本品是按照國(guó)家保健食品的法規(guī)要求，考察其遺傳毒性。本實(shí)驗(yàn)采用Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)評(píng)價(jià)不同濃度的古嶺龍酒的抗突變作用?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 古嶺龍保健酒 (規(guī)格:125mL/瓶、批號(hào):2009121001)，實(shí)驗(yàn)前按要求把古嶺龍保健酒用水浴濃縮成濃縮液 (比重為1.3，不含乙醇);91%乙醇的酒基(含40%乙醇的酒基經(jīng)二次蒸餾得到)(均由廣西柳州市古嶺酒廠提供);環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào): 1106114);敵克松、疊氮鈉、2－氨基芴均購(gòu)自Sigma公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(桂) 2009－0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):0001412。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室溫度:22～25℃，相對(duì)濕度:55～75%。喂顆粒飼料，自由飲水。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株 鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型系列菌株TA97a、TA98、TA100、TA102由廣西區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供。菌株經(jīng)組氨酸依賴性試驗(yàn)、結(jié)晶紫抑菌試驗(yàn)、紫外線敏感試驗(yàn)、R因子的鑒定和PAQ1質(zhì)粒的鑒定，自發(fā)回變數(shù)和鑒別性致突變物反應(yīng)均合格。

1.2 方法

1.2.1 Ames試驗(yàn)［1］采用平板摻入法。用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四種菌株進(jìn)行試驗(yàn)。以多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶 (S－9)作為體外代謝活化系統(tǒng)。采用平板摻入法，在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入0.1mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1mL受試物溶液和0.5mL S－9混合液 (當(dāng)需要代謝活化時(shí))，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上。5個(gè)試驗(yàn)劑量分別為5000、1000、200、40、8μg/皿，同時(shí)設(shè)自發(fā)回變對(duì)照、溶劑對(duì)照和陽(yáng)性突變劑對(duì)照。自發(fā)回變對(duì)照除不加樣品外，其余條件與樣品組相同。溶劑對(duì)照用純水替代樣品，其余條件與樣品組相同。在無(wú)菌操作條件下，用滅菌純水將濃縮液樣品分別配成50、10、2、0.4、0.08mg/mL 5個(gè)濃度，經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過(guò)濾除菌后作為受試溶液。每個(gè)劑量組的各種菌株均做3個(gè)平行皿。在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)每皿的菌落數(shù)。整套試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)做兩次。如果受試物的回變菌落數(shù)增加超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，并具有劑量－反應(yīng)關(guān)系者，即為誘變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性。

1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)［2］選體重為25～30g的昆明種小鼠60只，隨機(jī)分成6組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)組3個(gè)劑量分別設(shè)21710、10855、5427.5mg/kg BW，設(shè)陰性對(duì)照 (純水)、酒基對(duì)照 (15%乙醇)和陽(yáng)性對(duì)照。稱取108.55g古嶺龍保健酒濃縮液樣品，加含91%乙醇的酒基至100mL，混勻，配成1085.5mg/mL濃度溶液，試驗(yàn)液的乙醇終濃度為15%;再用含15%乙醇的酒基溶液將1085.5mg/mL濃度溶液依次對(duì)倍稀釋成542.75、271.38mg/mL濃度，試驗(yàn)液的乙醇終濃度均為15%。按0.4mL/20g BW的體積給相應(yīng)劑量組動(dòng)物灌胃1085.5、542.75、271.38mg/mL濃度，陰性對(duì)照組灌給純水，酒基對(duì)照組灌給15%酒基溶液，陽(yáng)性對(duì)照組灌給2mg/mL的環(huán)磷酰胺 (cp)溶液 (劑量為40mg/kg BW)。第二次給受試物后6小時(shí)頸椎脫臼處死動(dòng)物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞 (PCE)，微核率以含微核的PCE千分計(jì)率，同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值 (PCE/ NCE)。采用泊松分布均數(shù)比較法統(tǒng)計(jì)處理。如試驗(yàn)組的微核率比陰性對(duì)照組增高，并有明顯的劑量－反應(yīng)關(guān)系和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)［3］選體重為25～35g的昆明種雄性小鼠60只，隨機(jī)分成6組，每組10只。試驗(yàn)組3個(gè)劑量分別設(shè)21710、10855、5427.5mg/kg BW，設(shè)陰性對(duì)照(純水)、酒基對(duì)照(15%乙醇)和陽(yáng)性對(duì)照(環(huán)磷酰胺)。稱取108.55g古嶺龍保健酒濃縮液樣品，加含91%乙醇的酒基至100mL，混勻，配成1085.5mg/mL濃度溶液，試驗(yàn)液的乙醇終濃度為15%;再用含15%乙醇的酒基溶液將1085.5mg/mL濃度溶液依次對(duì)倍稀釋成542.75、271.38mg/ mL濃度，試驗(yàn)液的乙醇終濃度均為15%。按0.4mL/20g BW 的體積給相應(yīng)劑量組動(dòng)物灌胃 1085.5、542.75、 271.38mg/mL濃度，陰性對(duì)照組灌給純水，酒基對(duì)照組灌給15%酒基溶液，陽(yáng)性對(duì)照組灌給2mg/mL的環(huán)磷酰胺(cp)溶液 (劑量為40mg/kg BW)。每天灌胃一次，連續(xù)5天。末次給樣后第30天處死動(dòng)物，取副睪的精子涂片，甲醇固定，伊紅染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)完整精子1000個(gè)，計(jì)算精子畸形率。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。在統(tǒng)計(jì)分析分析時(shí)，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異再用Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行多個(gè)劑量組與對(duì)照組均數(shù)間的兩兩比較。若方差不齊則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差性檢驗(yàn)后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍未達(dá)到方差齊要求，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)總體比較有差異。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)Ames試驗(yàn)的影響 表1、表2結(jié)果表明，古嶺龍保健酒各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的兩倍，亦無(wú)劑量－反應(yīng)關(guān)系，這表明古嶺龍酒在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，S－9對(duì)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型系列菌株TA97a、TA98、TA100、TA102四種試驗(yàn)菌株均無(wú)致突變性。

表1 古嶺龍保健酒Ames試驗(yàn)結(jié)果

2.2 陽(yáng)性對(duì)照 TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9采用2－氨基芴 (劑量為10μg/皿);TA98－S9采用柔毛霉素(劑量為6μg/皿);TA97a－S9、TA102－S9采用敵克松(劑量為50μg/皿);TA100－S9采用疊氮鈉 (劑量為1.5μg/皿);TA102+S9采用1，8－二羥基蒽醌 (劑量為50μg/皿)。表2同。

表2 古嶺龍保健酒Ames試驗(yàn)結(jié)果 (第二次)

2.3 對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)的影響 表3結(jié)果表明，古嶺龍保健酒各劑量組小鼠的骨髓細(xì)胞微核率與酒基對(duì)照和陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性 (P＞0.05)，而環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異有極顯著性(P＜0.01)。古嶺龍酒對(duì)小鼠的骨髓細(xì)胞染色體未見損傷。

2.4 對(duì)小鼠精子畸形試驗(yàn)的影響 表4結(jié)果表明，古嶺龍保健酒各劑量組對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率未產(chǎn)生明顯改變，樣品各劑量組的精子畸形率與酒基對(duì)照和陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性 (P＞0.05)，而環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異有極顯著性 (P＜0.01)，說(shuō)明該樣品無(wú)致小鼠精子產(chǎn)生畸變作用。

3 討論

本項(xiàng)研究執(zhí)行《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》和 (GB15193－94)。Ames試驗(yàn)從基因水平上反映了遺傳物質(zhì)受損傷情況，微核的產(chǎn)生與染色體斷裂及紡錘體受損有關(guān)，微核率的大小可間接反映染色體受損情況。本研究結(jié)果顯示，在無(wú)論有無(wú)活化系統(tǒng) (S－9混合液)存在情況下，古嶺龍酒對(duì)TA97a、TA98、TA100、TA102四種菌株各劑量組的回變菌落數(shù)均接近自發(fā)突變，與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，亦無(wú)劑量－反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果提示古嶺龍酒在體外Ames試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)致突變作用。在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠的骨髓細(xì)胞有致突變作用，也未發(fā)現(xiàn)對(duì)試驗(yàn)小鼠精子產(chǎn)生畸變作用。

表3 古嶺龍保健酒對(duì)小鼠的骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響

表4 古嶺龍保健酒對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

在本試驗(yàn)條件下，上述結(jié)果表明古嶺龍保健酒沒有遺傳毒性和潛在致癌性。因此，古嶺龍酒在遺傳毒性方面是安全的。

［1］衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶實(shí)驗(yàn)》，2003:189.

［2］衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)《骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)》，2003:198.

［3］衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)《小鼠精子畸形試驗(yàn)》，2003:203.