艾 民 趙 娜 常亞娟

黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150040

乙型肝炎病毒 (HBV)感染人數眾多，我國HBV感染率為60%，乙肝表面抗原陽性率約10%［1］，是導致慢性肝病最常見的原因。HBV感染可以引起肝細胞的免疫性損害，其病理過程涉及到T細胞、B細胞、NK、NKT等細胞［2］。本文通過分析慢性乙肝病人與健康人免疫細胞的差異，來探討乙型肝炎發(fā)病機制與宿主細胞免疫功能的關系。

1 材料和方法

2009年10月至2010年3月在黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院就診的慢性乙型肝炎病人32例和健康人20例，診斷符合肝病學會聯(lián)合修訂的病毒性肝炎的診斷標準［3］。乙肝患者中男23例、女9例，年齡18－63歲，平均年齡34 ±13歲，血清中谷丙轉氨酶均超過正常2倍以上。所有病人均未接受過任何與肝病相關的治療。健康對照組20例，男14例、女6例，年齡18－61歲，平均年齡34±9歲。

1.1 儀器與試劑 使用美國BD公司FACSCuliber流式細胞儀測定樣本中的淋巴細胞亞群，試劑均由該公司提供。

1.2 檢測方法 標本制備:(1)用K2－EDTA抗凝管收集外周靜脈血2m l混勻，2m l用于流式細胞儀測定，室溫下送檢。(2)抗體標記:取2支檢測管，分別加入如下抗體組合，每種抗體20μl。①CD4、CD8、CD3細胞亞群抗體;②CD16+56、CD19抗體;(3)上述管中加入50μl全血，混勻避光室溫孵育20分鐘;(4)加入500μlOPTILYSE－C溶血素，混勻避光26℃水浴溶血10分鐘;(5)加入2 m lPBS洗液，振蕩混勻，1500 r/min，離心5 min，棄上清;(6)重復步驟(5);(7)每管加入0.5 mlPBS洗液，混勻避光放置，2 h內完成上機檢測。儀器檢查達標準后開始檢測。每管讀取細胞5000個，將流式細胞儀檢測的各亞群占淋巴細胞總數的百分比與血常規(guī)結果中淋巴細胞計數值相乘，得到各亞群細胞的數。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數據用 ±S表示。采用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析。多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

每組之間淋巴細胞亞群、淋巴細胞及白細胞總數進行比較:病人組淋巴細胞和白細胞計數顯著低于對照組。淋巴細胞亞群中B細胞計數、NK細胞計數低于對照組(見表1);外周血CD4+T、CD8+細胞低于對照組 (見表2)。

表1 兩組之間外周血淋巴細胞各亞群的比較 (平均值±S)

表2 各組之間外周血CD4+T細胞及CD8+T細胞的比較 (平均值±S)

3 討論

HBV主要是通過引起宿主自身的免疫反應而造成肝細胞的損傷。國內外初步研究顯示，慢性乙型肝炎病人體內存在著細胞免疫功能的紊亂，T淋巴細胞亞群失衡，使機體不能有效清除入侵的乙肝病毒，導致疾病的慢性化［4－5］。我們通過檢測慢性乙肝病人和正常人的淋巴細胞亞群的變化，來了解是否存在淋巴細胞亞群免疫功能紊亂。實驗結果顯示，與正常對照相比，慢性乙肝患者CD4+、CD8+T細胞計數減少。CD4+T為輔助性T細胞，能促進B細胞等其他免疫細胞的增殖和分化，調節(jié)體液免疫和細胞免疫; CD8+T細胞由細胞毒性T淋巴細胞和抑制性T細胞組成。國內外研究顯示在急性乙肝患者體內存在著針對乙型肝炎病毒強烈多克隆CD4+T細胞反應和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應，而在慢性乙肝患者中這種反應很弱或檢測不到。這就提示乙型肝炎病毒感染后HBV特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞反應對病毒的清除和疾病的轉歸起重要的作用。CD4+T細胞和CD8+T細胞計數的減少，可能導致機體細胞免疫功能降低，乙肝病毒感染后不易被清除，與疾病慢性轉歸密切相關，但是，CD8+T細胞數量改變不能完全反映其功能上的變化，并且外周血中CD8+T細胞數量并不能完全反映肝細胞的情況。因此，尚需完善T細胞功能方面的檢測及進行肝組織活檢來進一步分析CTL與乙肝臨床轉歸的關系。

慢性乙肝患者NK細胞計數低于正常對照。NK細胞是機體自然免疫的主要承擔者，也是獲得性細胞免疫的核心細胞。研究發(fā)現(xiàn)NK細胞缺陷的病人易發(fā)生多種危及生命的病毒感染，這可能與NK細胞缺乏導致的CTL功能喪失有關［6］。在對乙肝病毒的細胞免疫中HBV特異性的CTL反應對疾病的轉歸起著決定性作用。因此NK細胞減少可能與HBV感染后慢性轉歸密切相關。與正常對照相比，慢性乙肝患者外周血B淋巴細胞亞群比例升高。B淋巴細胞具有產生抗體、清除、提呈抗原、分泌細胞因子參與自身免疫等作用［7－8］，B細胞通過分泌抗體中和游離的病毒顆粒，阻止病毒進入肝細胞和阻止細胞間的病毒傳播［9］?；罨疊細胞是一類抗原呈遞細胞，能夠產生大量參與免疫調節(jié)、炎癥反應及造血過程的細胞因子，與慢性乙肝的關系還須進行深入研究。

綜上所述:慢性乙型肝炎患者和正常人T細胞亞群、NK細胞、B淋巴細胞存在差異，慢性乙肝患者體內存在T淋巴細胞亞群失衡、細胞免疫功能紊亂及體液免疫異常的情況，這可能與乙肝病毒感染后慢性化密切相關。

［1］田瑛，邱志峰，李太生.慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒攜帶者外周血T細胞亞群的變化和意義中華醫(yī)學雜志，2005，47(185).

［2］楊斌，遲淑萍，陳黎明等.慢性乙型肝炎患兒外周血B淋巴細胞亞群的臨床意義分析［J］.人民軍醫(yī)，2009，5:313－314.

［3］中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案.中華肝臟病雜志，2000，8:324－329.

［4］FeiGZ，Sylvan SP，YaoGB，et al Quantitativemonitoring ofserumhepatitisB virusDNA and blood lymphocyte subsetsduring combinedprednisolone and interferon－alpha therapy in patients with chronichepatitisB.JViralHepat，1999，6:219－227.

［5］徐志強，張鴻飛，楊曉晉等.小兒慢性乙型肝炎外周血T細胞亞群和臨床病理關系的研究.中華實驗和臨床病毒學雜志，2004，18:142－144.

［6］田志剛.NK細胞研究的幾個熱點問題.中國免疫學雜志，1999，15: 142－144.

［7］Baumgarth N，Herman OC，Jager GC，et al.B－1 and B－2 cell－derived immunoglobulin M antibody are nonredundant components ofthe protective response to influenza virus infection［J］.JExp Med2000，192(2):271.

［8］Martin F，Oliver AM，Kearney JF·Marginal zone and B1 B cellsunitein the early response against T－independent blood－borne particu－late antigens［J］.Immunity，2001，14(5):617.

［9］Toubi E，Kessel A，Peri R，Shmuel Z，et al.Enhanced apoptosis ofperipheral CD5－negative B lymphocytes from chronically hepatitis Cvirus－infected patients:Reversal after antiviral treatment［J］·JVirol，2004，78(20):11 379.