李新偉，周井祥，朱 霞，王 好

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實驗室，吉林 長春 130118）

錦鯉皰疹病毒?。╧oi herpesvirus disease，KHVD）是由錦鯉皰疹病毒（koi herpesvirus，KHV）感染錦鯉、鯉及其普通變種如框鏡鯉等而導(dǎo)致的一種具有高度傳染性和致死性的疾病。該病多發(fā)生在水溫為18℃～28℃的春秋季節(jié)，具有高度傳染性，發(fā)病率和死亡率均可高達(dá)80%～100%［1］。

該病于1998年首次在以色列的 Magan Michael地區(qū)和美國暴發(fā)［2］，之后迅速傳播至世界各地。目前，該病在我國的鯉魚養(yǎng)殖中頻繁暴發(fā)，給鯉魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重危害。2007年國家質(zhì)檢總局發(fā)布警示預(yù)報，要求將KHV作為必檢項目，并將KHV和鯉春病毒病（spring viraemia of carp，SVC）一起作為近年來水生動物疫病的重點(diǎn)監(jiān)測對象，但是目前國內(nèi)還沒有制訂有關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)。本試驗綜合臨床癥狀觀察、剖檢、細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，對吉林省伊通縣某鯉魚養(yǎng)殖場一例疑似KHVD病例進(jìn)行了確診，報告如下。

1 臨床診斷

2011年8月份因試驗需要，本實驗室從吉林省伊通縣某鯉魚養(yǎng)殖場購買了600尾一日齡鯉魚。自購買的當(dāng)天晚上開始，所購買鯉魚出現(xiàn)游泳異常，反應(yīng)遲鈍，呼吸困難，體表附有白色的不規(guī)則白斑，進(jìn)而整個體表披上白色云霧狀膜等癥狀。第2天該批鯉魚出現(xiàn)死亡，死亡魚鰓出血壞死，眼睛凹陷，剖檢后發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官－腎臟充血腫大呈暗紅色；肝、胰臟腫大呈灰白色。由于臨床癥狀與剖檢結(jié)果均與英國、以色列、美國等國家報道過的錦鯉皰疹病毒病極相似，因此初步確定此批魚感染了KHV。

2 實驗室診斷

2.1 細(xì)胞分離技術(shù)檢測 取活體患病魚，無菌取出腎臟，制備成腎細(xì)胞懸液，將其接種于框鏡鯉尾鰭原代細(xì)胞（MFC）單層，22℃下吸附1 h后，加入含有5%血清的M199，22℃條件下繼續(xù)共培養(yǎng)。逐日觀察細(xì)胞病變情況，最后收集細(xì)胞病變達(dá)70%～80%的細(xì)胞及上清液，進(jìn)行電鏡觀察。

2.2 PCR檢測 參考GenBank公布的KHV美國株全基因序列，選取大小為771 bp的ORF81基因，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計1對特異性診斷引物，F(xiàn)1：5′-GGATCCATGGCAGTCACCAAAG-3′；F2：5′-GTCGACTCACCACATCTTGCCG-3′，擴(kuò) 增 片段大小為771 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

按照常規(guī)方法提取發(fā)病鯉魚腎臟組織DNA后，采用25μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體反應(yīng)體系為：在0.5 m L PCR管中依次加入1μL DNA產(chǎn)物，2μL d NTP，0.25μL ExTaqDNA 聚合酶，2.5μL10×PCR反應(yīng)Buffer，混勻后加雙蒸水補(bǔ)足25μL。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃，5 min；變性94℃，40 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，1 min；擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為35次。最后，反應(yīng)體系于72℃總延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。將PCR產(chǎn)物與DNA Marker進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，采集圖像。

2.3 ORF81基因序列測序 將目的片段純化回收后，與p MD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選單菌落，提取陽性重組質(zhì)粒后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，將測序結(jié)果與NCBI上已公布的KHV ORF81核酸序列進(jìn)行BLAST序列比對。

3 檢測結(jié)果

3.1 細(xì)胞病變及病毒電鏡觀察結(jié)果 MFC接種患病魚組織10 d后出現(xiàn)明顯病變，病變與Pikarsky E等［3］描述的一致。電鏡下觀察到了典型的KHV病毒粒子，與文獻(xiàn)描述相符［4］。

圖1 MFC接種患病鯉魚組織后產(chǎn)生的細(xì)胞病變

圖2 電鏡下觀察到的病毒形態(tài)

3.2 PCR結(jié)果 如圖3所示，以提取的發(fā)病鯉魚腎臟組織DNA為模板，在預(yù)期位置擴(kuò)增出KHV的特異性條帶，大小為771 bp左右。

圖3 基因片段的PCR擴(kuò)增

3.3 測序結(jié)果 測序結(jié)果表明，患病魚腎臟組織中擴(kuò)增的目的片段與GenBank上登錄的KHV美國株ORF81基因序列的同源性為99%。

4 結(jié)語與建議

根據(jù)剖檢、細(xì)胞分離技術(shù)檢測、PCR檢測及測序結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀觀察，確診該鯉魚養(yǎng)殖場鯉魚感染了KHV。

由于目前KHV的傳播途徑及傳播媒介都不是很清楚，所以還無法確定該養(yǎng)殖場受感染鯉魚的病原來源。為了控制疫情流行，建議采取以下措施：首先及時向漁業(yè)主管部門上報；其次必須采取嚴(yán)格的隔離措施，對已發(fā)病的池塘或地區(qū)首先進(jìn)行封鎖，對池內(nèi)的養(yǎng)殖動物不向其他池塘和地區(qū)轉(zhuǎn)移，不排放池水，工具未經(jīng)消毒不在其他池使用。與此同時，飼養(yǎng)人員要勤于清除發(fā)病死亡尸體，及時掩埋、銷毀，以免疫情傳播蔓延。

［1］Gilad O，Yun S，Andree B.Initial characteristics of koi herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi，Cyprinus carpio koi［J］.Dis Aqua Org，2002，48（2）：101-108.

［2］Hedrick R P，Gilad O，Yun S，etal.A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi，a strain of common carp［J］.Journal of Aquatic Animal Health，2000，12（1）：44-57.

［3］Pikarsky E，Ronen A，Abramowitz J，etal.Pathogenesis of Acute Viral Disease Induced in Fish by Carp Interstitial Nephritis and Gill Necrosis Virus［J］.Journal of Virology，2004，78（17）：9544-9551.

［4］Marina H，Ronen A，Perelberg A，etal.Description of an as Yet Unclassified DNA Virus from Diseased Cyprinus carpio Species［J］.Journal of Virology，2005，79（4）：1983-1991.