張建勛，王戰(zhàn)輝，王亞輝，吳小平，李建成，王照鵬，江海洋，沈建忠

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.遼寧省畜牧獸醫(yī)局，遼寧 沈陽(yáng) 110001；3.北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京 海淀 100085）

三聚氰胺（Melamine，MEL）是典型的三嗪類化合物，分子式為C3H6N6，主要用于生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂。目前食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測(cè)試大多采用測(cè)定總氮的方法，因三聚氰胺含氮量高達(dá)66%左右［1］，故而常被非法添加至食品和飼料中以提高蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，給消費(fèi)者健康帶來(lái)危害。

目前，關(guān)于檢測(cè)食品及飼料中三聚氰胺的殘留的方法，國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道，其中包括高效液相色譜 法 （HPLC）［2］、高 效 液 相 色 譜－串 聯(lián) 質(zhì) 譜 法（HPLC-MS／MS）［3－4］、氣相色譜－質(zhì)譜法（GC-MS）［5］等。這些方法雖能準(zhǔn)確檢測(cè)，但都需要大型儀器，樣品前處理步驟復(fù)雜、耗時(shí)，因此，建立靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法是非常必要的。

本試驗(yàn)通過制備三聚氰胺抗原、抗體，建立牛奶及奶粉中三聚氰胺快速檢測(cè)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研制牛奶及奶粉中三聚氰胺快速檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要試劑 三聚氰胺（Melamine，99.0%），牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，聚乙二醇（PEG），均購(gòu) 自 Sigma 公 司；4，6-二 氨 基-2-氯-1，3，5-三 嗪（CAAT，98.0%），購(gòu)自北京易萊西諾生物科技有限公司；對(duì)氨基苯丁酸及其他試劑均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基，HAT，HT培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司。

1.2 主要溶液（0.02 mol／L，p H 值7.2 PBS；包被液（0.05 mol／L，p H 值9.6 碳酸鹽緩沖液） 洗滌液（含0.05%吐溫20的 PBS）；封閉液（2%包被液）；樣品稀釋液（Na2HPO4·12H2O 12.48 g，Na H2PO4·2H2O 7.04 g，加水至400 m L）.

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物和融合細(xì)胞 BALB／c小鼠，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心；SP2／0細(xì)胞，由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 三聚氰胺免疫原和包被原的合成 稱取CAAT 0.430 g懸浮于10 m L無(wú)水乙醇中，加入0.5 g對(duì)氨基苯丁酸，加入KOH，使其終濃度為85%；反應(yīng)混合物75℃水浴回流24 h，分別在16 h和19 h的時(shí)候，加入0.37 g對(duì)氨基苯丁酸和180 mg KOH；產(chǎn)物過濾，減壓蒸餾，獲得油狀物質(zhì)。產(chǎn)物溶解于30 m L 5%碳酸鈉溶液，10 m L二氯甲烷洗滌兩次，水相用濃鹽酸調(diào)p H值至1，收集沉淀，干燥獲得三聚氰胺半抗原，命名為p-ABTAAT。

p-ABTAAT溶解于N，N-二甲基甲酰胺，分別加入等摩爾數(shù)的DCC和NHS，室溫反應(yīng)12 h，離心，除去沉淀，得到溶液Ⅰ；向溶液Ⅰ中加入溶有100 mg BSA或67 mg OVA的水溶液5 m L，室溫反應(yīng)12 h；反應(yīng)液用蒸餾水透析5 d，離心分離出上清液，即得到三聚氰胺免疫原或包被原p-ABTAAT-BSA（或p-ABTAAT-OVA）。

2.2 動(dòng)物免疫 取100μg p-ABTAAT-BSA偶聯(lián)物，加等量弗氏佐劑，制成乳化劑，免疫8周齡雌性BALB／c小鼠5只，免疫6次，每次間隔2周。除最后1次免疫為腹腔注射外，其余均為頸背部皮下多點(diǎn)注射。3免后7～10 d，小鼠眼眶采血，采用間接ELISA方法測(cè)定血清效價(jià)。

2.3 三聚氰胺單克隆抗體的制備

2.3.1 細(xì)胞融合 選取血清效價(jià)高和抑制效果好的小鼠用作融合。取小鼠脾細(xì)胞與SP2／0細(xì)胞在PEG2000作用下融合。將融合后細(xì)胞懸液加入到鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，以HAT和HT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)。

2.3.2 雜交瘤細(xì)胞篩選及克隆化 融合后7～10 d采用間接ELISA方法篩選效價(jià)高的陽(yáng)性細(xì)胞，再采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞分泌的抗體是否對(duì)三聚氰胺具有特異性。選擇OD值較高且克隆數(shù)目較少的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行4次亞克隆。

2.3.3 單克隆抗體的生產(chǎn) 取雌性BALB／c小鼠，注射滅菌石蠟油0.5 m L／只，7～15 d腹腔注射陽(yáng)性克隆雜交瘤細(xì)胞0.5×106／m L～1×106／m L／只。10 d后，抽取小鼠腹水。經(jīng)辛酸－飽和硫酸銨法提純，分裝凍干保存。

2.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用包被緩沖液將包被抗原p-ABTAAT-OVA稀釋為一定濃度，100μL／孔，4℃過夜；傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌4次，拍干。每孔加入150μL封閉液，37℃恒溫封閉1 h，洗滌4次，拍干；將50μL抗體與等體積倍比稀釋的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液加到酶標(biāo)板上反應(yīng)，每孔100μL，37℃反應(yīng)1 h，洗滌4次，拍干；每孔加入100μL HRP-羊抗鼠IgG，37℃反應(yīng)1 h，洗滌4次，拍干；每孔加入TMB溶液100μL，37℃顯色15 min，然后每孔加入50μL 2 mol／L H2SO4以終止反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD450nm值。

2.5 交叉反應(yīng)率的測(cè)定 采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，將其他藥物系列稀釋，用交叉反應(yīng)待測(cè)藥物代替三聚氰胺。用下式計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物與三聚氰胺抗體的交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率＝［IC50（melamine）／IC50（競(jìng)爭(zhēng)物）］×100%

2.6 樣品處理

2.6.1 牛奶 取100μL加入900μL樣品稀釋液，充分混勻，取50μL用于檢測(cè)。

2.6.2 奶粉 稱取1.00±0.01 g于50 m L離心管中；加入6 m L蒸餾水充分混勻；取100μL加入900 μL樣品稀釋液，充分混勻；取50μL用于檢測(cè)。

2.7 添加回收率的測(cè)定 以500μg／L、1 000μg／L和2 000μg／L 3個(gè)濃度添加牛奶；以1.0 mg／kg、2.0 mg／kg和3.0 mg／kg 3個(gè)濃度添加奶粉。按照2.6所述方法進(jìn)行提取。

3 結(jié)果與分析

3.1 三聚氰胺半抗原的鑒定 經(jīng)質(zhì)譜鑒定半抗原結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其分子離子峰為289（M＋1）。半抗原化合物的元素分析結(jié)果（%）：C，54.16；H，5.59；N，29.15；O，11.10。由上可知，化合物的分子量為288，分子中含有2個(gè)O，13個(gè)C。說(shuō)明三聚氰胺半抗原合成成功。

3.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 細(xì)胞融合后第7天，取上清液用間接ELISA方法檢測(cè)。選擇陽(yáng)性中OD值高的，克隆數(shù)目較少的孔，經(jīng)過4次亞克隆，得到1株能穩(wěn)定分泌三聚氰胺單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為5F9。體內(nèi)誘生腹水法獲得單克隆抗體，腹水效價(jià)可達(dá)1.5×105。

3.3 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 確定包被抗原的最佳稀釋濃度為1∶2 000，單克隆抗體的工作濃度為1∶80 000。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法建立檢測(cè)三聚氰胺的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，此抑制曲線針對(duì)三聚氰胺的IC50為61.3 ng／m L。見圖1。

圖1 三聚氰胺間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4 交叉反應(yīng)率的測(cè)定 該株單抗與三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、4，6-二氨基-2-氯-1，3，5-三嗪的交叉反應(yīng)率分別為100.0%、1.3%、1.67%、2.45%、2.75%。見表1。

3.5 添加回收率的測(cè)定 以500μg／L、1 000μg／L和2 000μg／L 3個(gè)濃度添加牛奶，回收率在76.4%～91.0%，變異系數(shù)在2.4%～14.5%；以1.0 mg／kg、2.0 mg／kg和3.0 mg／kg 3個(gè)濃度添加奶粉，回收率在68.1%～83.8%，變異系數(shù)在3.4%～9.0%。結(jié)果見表2。

表1 三聚氰胺單克隆抗體的交叉反應(yīng)率

表2 牛奶及奶粉中三聚氰胺的添加回收結(jié)果

4 討論

4.1 三聚氰胺人工抗原的制備 免疫半抗原設(shè)計(jì)的原則是免疫半抗原與載體連接后能最大程度的保持和突出待測(cè)物的特征結(jié)構(gòu)［6］。三聚氰胺分子上有3個(gè)氨基，它們的反應(yīng)活性是一樣的，若采用戊二醛法或通過鹵代羧酸將氨基取代，則很有可能形成一元、二元甚至三元取代的混合物。這樣的話，就破壞了三聚氰胺游離氨基的特征結(jié)構(gòu)。因此，選擇4，6-二氨基-2-氯-1，3，5-三嗪作為先導(dǎo)化合物，CAAT 上的 Cl原子很容易被對(duì)氨基苯丁酸的氨基H原子取代，形成能最大程度保留三聚氰胺特征結(jié)構(gòu)的半抗原。

4.2 三聚氰胺單克隆抗體 根據(jù)表1中交叉反應(yīng)率的測(cè)定結(jié)果，說(shuō)明該抗體的特異性較高。同時(shí)表明三嗪環(huán)上的3個(gè)氨基在與抗體識(shí)別過程中發(fā)揮著重要作用。另外，就4，6-二氨基-2-氯-1，3，5-三嗪的低交叉反應(yīng)率，可能與其結(jié)構(gòu)上的氯原子的強(qiáng)吸電子效應(yīng)有關(guān)。

4.3 牛奶、奶粉樣品的測(cè)定 免疫分析方法的樣品前處理較為簡(jiǎn)單，但基質(zhì)效應(yīng)對(duì)免疫測(cè)定有一定影響。Yin［7］等建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)牛奶、奶粉及飼料中三聚氰胺殘留時(shí)，將牛奶樣品10倍稀釋后直接測(cè)定，奶粉樣品經(jīng)0.02 M醋酸緩沖液沉淀蛋白，上清液10倍稀釋后測(cè)定。本試驗(yàn)中，對(duì)牛奶、奶粉都是直接10倍稀釋后上樣檢測(cè)。從對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的分析來(lái)看，1∶10倍稀釋的樣品已基本上消除了生物基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響。

該方法快速、靈敏、簡(jiǎn)便、可靠，完全符合目前對(duì)牛奶及奶粉中三聚氰胺快速檢測(cè)的需求。

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