邱 立，郝華芳，王興龍，張淑霞，張耀相，張渭東，楊增岐

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

沙門菌是腸桿菌科中一大類重要的人畜共患病病原菌，廣泛分布于自然界，是畜禽肉胴體、畜禽產(chǎn)品污染的重要來源，感染畜禽后可引起一系列的疾病，并可通過消化道等途經(jīng)傳染給人，引起人的食源性疾病。

目前已發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒、豬霍亂、都柏林沙門菌病、腸炎、羊流產(chǎn)、馬流產(chǎn)、雞傷寒、雞白痢、傷寒、丙型副傷寒等沙門菌具有毒性質(zhì)粒，可增強(qiáng)對(duì)寄主腸黏膜上皮細(xì)胞的粘附與侵襲作用，提高在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中存活和增殖的能力，其對(duì)小鼠的毒性比無(wú)毒性質(zhì)粒菌株強(qiáng)數(shù)百至數(shù)萬(wàn)倍不等［1－2］。然而到目前為止，用于鑒定沙門菌毒力的方法十分有限。小鼠致病性試驗(yàn)是常用來評(píng)價(jià)細(xì)菌毒力的方法，但是受到小鼠品系、日齡、體重等多種因素影響，鑒定結(jié)果穩(wěn)定性差，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。特別是在獸醫(yī)臨床實(shí)踐中，快速確定病因能夠有效減少經(jīng)濟(jì)損失，而沙門菌是臨床病料中最常分離到的細(xì)菌之一，快速確定沙門菌有無(wú)毒力，對(duì)準(zhǔn)確確定病因具有重要意義。多重PCR方法，能夠快速簡(jiǎn)便的鑒定有毒力的沙門菌，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確［3］，如果該方法同樣能夠準(zhǔn)確鑒定臨床分離沙門菌毒力，將在給獸醫(yī)臨床診斷帶來極大方便。

為檢驗(yàn)多重PCR檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用效果和研究陜西關(guān)中地區(qū)致病性沙門菌的流行情況，進(jìn)行了以下試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 病料 在陜西楊凌、武功、寶雞等發(fā)病的畜禽場(chǎng)，無(wú)菌采取病死動(dòng)物的肝臟、脾臟或發(fā)病部位；2～3周發(fā)病動(dòng)物，用棉拭子采集新鮮糞便或采集尿液，無(wú)菌導(dǎo)尿或采集中段尿。A、D、E、G病料為豬病料，B病料為雞病料，C病料為羊病料，F(xiàn)病料為奶牛病料。

1.2 培養(yǎng)基 普通培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅－美藍(lán)培養(yǎng)基、S.S.瓊脂平板、蘇木素伊紅瓊脂培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基（BS）、普通肉湯等。硝酸鉀蛋白胨水，鄧亨氏蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，明膠培養(yǎng)基，檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基，三糖鐵培養(yǎng)基，O／F培養(yǎng)基及各種糖培養(yǎng)基等，均按常規(guī)方法［6－7］制備。

1.3 試劑 革蘭染色液、歐立希氏試劑、硝酸鉀還原試驗(yàn)用甲液和乙液、M.R.試驗(yàn)的甲基紅溶液、3%H2O2、10%FeCl3、V-P試驗(yàn)用甲液和乙液等，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。DL-2 000、d NTP、Taq酶等試劑，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 PCR引物 針對(duì)沙門菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子hisJ、毒力質(zhì)粒spvR基因、fliC基因的特異性引物由獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，序列見文獻(xiàn)［3］。

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將不同病料增菌，普通肉湯增菌，肉湯培養(yǎng)物變混濁，對(duì)增菌后的肉湯進(jìn)行稀釋，針對(duì)不同形態(tài)的菌落，涂片、染色、鏡檢，采取劃線法進(jìn)行挑純培養(yǎng)，直到獲得純培養(yǎng)物，置4℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)菌的生化鑒定 用分離菌純培養(yǎng)物有目的進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，按文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行。

1.7 細(xì)菌的致病性試驗(yàn) 37℃培養(yǎng)分離鑒定的6株沙門菌，OD600達(dá)到1.0時(shí)用于攻毒試驗(yàn)，接種方法按文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行。分別腹腔注射5只昆明系小鼠（購(gòu)自解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)），每只小鼠注射108個(gè)菌落形成單位的細(xì)菌（CFU／m L），每隔6 h記錄小鼠死亡情況。

1.8 DNA提取和PCR檢測(cè) 參考劉華偉［6］等方法，進(jìn)行沙門菌的DNA提取和多重PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果 共分離菌株19株，分別用A1、A2、A3、B1、B2、C1、C2、C3、D1、D3、E1、E2、F1、F2、F3、G1、G2、G3、G4表示。

2.2 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果 根據(jù)文獻(xiàn)［7］進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，據(jù)生化試驗(yàn)結(jié)果可知19株細(xì)菌中A1為豬霍亂沙門菌、A2為大腸桿菌、A3為豬葡萄球菌；B1為金黃色葡萄球菌、B2為雞沙門菌；C1為大腸桿菌、C2為費(fèi)氏檸檬酸桿菌、C3為沙門菌I系；D1為溶血葡萄球菌、D2為不活躍大腸埃希氏菌；E1為沙門菌I系、E2為革蘭陽(yáng)性球菌，未確定菌株；F1為大腸桿菌、F2為金黃色葡萄球菌、F3為鼠傷寒沙門菌；G1為革蘭陽(yáng)性球菌，未確定菌株，G2為豬葡萄球菌、G3為腸鏈球菌、G4為豬傷寒沙門菌，生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 病料分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 PCR 鑒定結(jié)果 利用 SJF1／SJR1，SPF2／SPR2，SHF1／SHRi對(duì)分離菌株進(jìn)行三重PCR檢測(cè)，PCR結(jié)果如圖1所示，A1、B2、C3、E1、F3、G4擴(kuò)增出359 bp大小的hisJ條帶，為沙門菌菌株，A1、B2、F3擴(kuò)增出大小為789 bp大小的spvR的條帶，為含毒力基因的菌株，而F3菌株還擴(kuò)增出大小為523 bp的flic-i基因，表明F3菌株含有 H1-i抗原。

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果 每組用5只小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，記錄攻毒小鼠死亡時(shí)間，并取死亡鼠脾臟進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果見圖2和表2。小鼠最早死亡時(shí)間是攻毒后12 h，A1組5只小鼠最早全部死亡，最后1只小鼠死亡時(shí)間為攻毒后24 h，B2組和F3組最后一只小鼠死亡時(shí)間分別為攻毒后36 h和攻毒后30 h。G4組1只小鼠死亡，C3組和E1組小鼠未見死亡。對(duì)照組全部存活。

圖1 三重PCR檢測(cè)部分分離菌株

表2 沙門菌分離株感染小鼠的死亡率、分離率及剖檢變化

圖2 攻毒后小鼠存活只數(shù)

3 討論

PCR（Polymerase Chain Reaction）是一種特異基因的體外快速擴(kuò)增技術(shù)，相比傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法具有無(wú)需培養(yǎng)、快速簡(jiǎn)便、特異性高、靈敏性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于病原微生物的快速檢測(cè)，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病原微生物標(biāo)本的快速檢測(cè)。多重PCR技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)一種致病菌的多個(gè)基因，也可以同時(shí)檢測(cè)多種致病菌，相比普通PCR技術(shù)具有特異性增強(qiáng)、節(jié)約試劑、工作量低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于包括沙門菌在內(nèi)的多種病原微生物的檢測(cè)與鑒定［8－11］。

傳統(tǒng)的沙門菌毒力檢測(cè)方法需要先進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，再結(jié)合生化分析和小鼠攻毒試驗(yàn)綜合判斷，檢測(cè)過程復(fù)雜、周期長(zhǎng)、所需試劑繁多。利用多重PCR技術(shù)可用于沙門菌毒力的快速檢測(cè)。

劉華偉等利用多重PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增沙門菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子hisJ基因、毒力質(zhì)粒spvR基因和H1抗原fliC基因。5株沙門菌強(qiáng)致病性標(biāo)準(zhǔn)菌株均能特異性擴(kuò)增出沙門菌毒力質(zhì)粒基因spvR［3］。但是該方法的推廣應(yīng)用，需要臨床樣品的檢驗(yàn)。因此，采集陜西省關(guān)中地區(qū)多家發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)病料，利用多重PCR技術(shù)和生化分析與小鼠攻毒試驗(yàn)分別對(duì)分離的可能的致病菌進(jìn)行鑒定，多重PCR技術(shù)結(jié)果與生化分析結(jié)果一致，毒力基因攜帶情況與小鼠攻毒結(jié)果基本一致，PCR對(duì)所有非沙門菌均表現(xiàn)為陰性；體現(xiàn)了該方法對(duì)臨床分離菌株應(yīng)用的準(zhǔn)確性。多重PCR不僅快速檢測(cè)出分離沙門菌，而且可以確定其毒力強(qiáng)弱，為沙門菌的流行病學(xué)調(diào)查和沙門菌食品污染檢疫帶來很大方便。

同時(shí)本次試驗(yàn)中探明在陜西關(guān)中地區(qū)流行的沙門菌具有多種類型，致病性強(qiáng)弱不同，并且致病性沙門菌菌株占總分離沙門菌菌株比例較高，說明沙門菌是陜西關(guān)中地區(qū)畜禽養(yǎng)殖的重要威脅，需要加強(qiáng)關(guān)注。

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