汪 燕， 邵建兵， 嚴(yán)小萍

(江蘇省如皋市人民醫(yī)院藥劑科， 江蘇 如皋 226500)

鳳尾草為鳳尾蕨科植物鳳尾草(Pteris multifida Poir)的全草或根，具有清熱解毒、涼血止血、消腫解毒等功效，民間用于治療肝炎、菌痢、淋濁、便血、扁桃體炎、癰腫瘡毒、濕疹等［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，鳳尾草含黃酮類、萜類化合物、甾醇類、揮發(fā)油、苯丙素類等成分，具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧自由基作用［2，3］。本文以衰老的自由基學(xué)說和免疫學(xué)說作為理論依據(jù)，分析探討鳳尾草抗衰老的作用及其機(jī)制，為鳳尾草的開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器:電子天平(BP221S，德國賽博尼斯);勻漿器(IKA T10，IKA公司);渦旋儀(XW－80A，上海滬西分析儀器廠);臺(tái)式離心機(jī)(SiGMA 1－13，美國SiGMA公司);迅達(dá)半自動(dòng)生化儀(C－82，上海迅達(dá)醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 試劑與動(dòng)物:鳳尾草(江蘇九泰醫(yī)藥集團(tuán));D－半乳糖(D－Galactose)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);一氧化氮(NO)試劑盒(硝酸還原法)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。清潔級(jí)昆明種小鼠70只，雄性，體重20±1g，江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào):蘇動(dòng)質(zhì)95040)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鳳尾草醇提物灌胃液制備:準(zhǔn)確稱取20g鳳尾草粉末(過40目篩)，置燒瓶中，加入450m L70%乙醇，室溫下浸泡12h后，超聲提取30min，抽濾，殘?jiān)俪曁崛∫淮?，合并兩次濾液，濃縮烘干，得到鳳尾草醇提物，臨用前取提取物加水配制成9mg/mL混懸液灌胃。

2.2 造模與分組:小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(B)、衰老模型組(m)、鳳尾草醇提物低劑量組(g1)，中劑量組(g2)，高劑量組(g3)。分組后即進(jìn)行衰老模型制備:模型組和各給藥組頸部皮下注射D－半乳糖200mg·kg－1·d－1，空白對(duì)照組頸部皮下注射等量生理鹽水，30d后，從空白對(duì)照組與模型組各取10只小鼠，頸脫椎處死，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)［4］，確定造模成功后，給藥組按81mg·kg－1·d－1，108mg·kg－1·d－1，135mg·kg－1·d－1分別灌胃給藥，模型對(duì)照組和空白組灌胃生理鹽水10mL·kg－1·d－1，15d 后處死所有小鼠，分取腦、胸腺和脾臟，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，按下式計(jì)算臟器系數(shù):臟器系數(shù)=(臟器重量/小鼠重量)×100%。

2.3 小鼠腦組織中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)含量測(cè)定:飼養(yǎng)45d后動(dòng)物脫頸椎處死，取腦，生理鹽水沖洗，拭干。精確稱取腦組織，加9倍體積氯化鈉溶液，勻漿，制取10%的腦組織勻漿待測(cè)。按照NO硝酸還原酶法試劑盒說明配制各試劑，540nm處測(cè)吸光度。同樣處理標(biāo)本，按照NOS測(cè)試盒(測(cè)總NOS)說明配制各試劑，530nm測(cè)吸光度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用Graph Pad軟件(Prism 5，version 5.01)進(jìn)行方差分析。

表1 小鼠脾臟和胸腺系數(shù)的變化

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 鳳尾草醇提物對(duì)小鼠免疫器官的影響:結(jié)果如表1所示，與空白組相比，模型組小鼠胸腺和脾臟系數(shù)變化均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該衰老小鼠模型體現(xiàn)免疫器官的變化。與空白對(duì)照組(b)相比，衰老模型組(m)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯降低，免疫器官代償性增重;與衰老模型組比較，模型給藥組能顯著提高脾臟指數(shù)，且呈現(xiàn)劑量關(guān)系。

從各組小鼠的胸腺、脾免疫器官的變化可以看出，D－半乳糖致衰老模型小鼠胸腺、脾免疫器官較空白組小鼠胸腺、脾免疫器官明顯萎縮，而鳳尾草具有增加衰老小鼠胸腺和脾的重量，提升免疫功能的作用。

3.2 鳳尾草醇提物對(duì)小鼠腦組織中NO含量的影響:結(jié)果見圖1，與正常對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠腦組織中NO含量明顯提高;給藥組小鼠腦組織中NO含量顯著低于衰老模型組;各給藥組NO含量與空白組NO含量無顯著差異(P＞0.05);給藥組NO含量呈劑量關(guān)系。表明鳳尾草可以顯著對(duì)抗小鼠腦組織氧自由基NO，從而起到延緩小鼠衰老的作用。

圖1:給藥小鼠腦組織中NO含量bvsm，p＜0.05;mvsg1、mvsg2 及mvsg3，P均小于0.05

3.3 鳳尾草醇提物對(duì)小鼠腦組織中NOS活力的影響:結(jié)果如圖2所示，與正常對(duì)照組(b)相比，衰老模型組(m)小鼠腦組織中NOS活性顯著升高;各給藥組小鼠腦組織中NOS活性顯著低于衰老模型組;各模型給藥組小鼠腦組織中NOS活性與空白組(b)無顯著差異，說明鳳尾草可能通過降低NOS活力對(duì)延緩小鼠衰老起作用，

圖2:給藥小鼠腦組織中NOS活力bvsm，P＜0.05;mvsg1、mvsg2及mvsg3，P均小于0.05

4 討論

4.1 D－半乳糖衰老模型是目前較多用的一種人工催老模型，具有衰老變化明顯、模型穩(wěn)定、耗時(shí)短等特點(diǎn)。D－半乳糖造成衰老模型是因代謝過程中機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，其表現(xiàn)為多種抗氧化酶活性下降，引起小鼠的腦老化效應(yīng)［5］，并在多種器官、組織的形態(tài)及生理、生化的許多觀測(cè)指標(biāo)上，均呈現(xiàn)出與自然衰老相似的改變［6］。

4.2 NO參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及呼吸消化系統(tǒng)的功能和介導(dǎo)免疫應(yīng)答等諸多生理和病理過程，是體內(nèi)重要的信使分子和神經(jīng)遞質(zhì)，與腦部學(xué)習(xí)及記憶密切相關(guān);同時(shí)又是一種極不穩(wěn)定的強(qiáng)氧化劑，過量的NO則會(huì)作為強(qiáng)氧化劑與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性更強(qiáng)的過氧化硝基基團(tuán)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性從而導(dǎo)致衰老的發(fā)生［7］。NOS是NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，研究表明，較低劑量的硝普鈉(Sodium Nitroprusside)能在體內(nèi)自發(fā)性釋放出NO，能使大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)提高。而NOS阻斷劑則使其學(xué)習(xí)成績(jī)下降;較高劑量的硝普鈉也可使學(xué)習(xí)成績(jī)降低，說明適量的NO可促進(jìn)學(xué)習(xí)能力，而過量的NO釋放則具有神經(jīng)毒性［8］。Cutler等研究了12種靈長(zhǎng)類和兩種嚙齒類動(dòng)物肝、腦和血漿等組織中的抗氧化性物質(zhì)，比較了這些動(dòng)物的最大壽命與抗氧化能力間的關(guān)系，結(jié)果表明，機(jī)體自由基生成量越少，抗氧化力(清除能力)越強(qiáng)，最大壽命就越大。氧自由基是衰老的決定因素，在衰老進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。因此，如能減少自由基生成和增強(qiáng)機(jī)體抗自由基能力、有效維持二者之間的動(dòng)態(tài)平衡，必定會(huì)有延緩衰老、促進(jìn)健康的作用［9］。

4.3 NO化學(xué)性質(zhì)活潑，半衰期很短，在體內(nèi)很快就代謝轉(zhuǎn)為 NO2－和 NO3－，而 NO2－又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為 NO3－，采用硝酸還原酶法可特異性地將 NO3－還原為NO2－，NO2－與Griess試劑發(fā)生重氮反應(yīng)生成粉紅色化合物，通過顯色深淺利用分光光度計(jì)在540nm處檢測(cè)其吸光度，吸光度與其濃度的高低呈正比。NOS催化LArg和分子氧反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度的大小可計(jì)算出NOS活力。

4.4 衰老的免疫學(xué)說認(rèn)為，胸腺是免疫系統(tǒng)的中樞器官，其衰退則T細(xì)胞減少，免疫殺傷力明顯降低，T細(xì)胞調(diào)控B細(xì)胞分泌抗體功能下降，產(chǎn)生自身免疫、T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素的能力下降，吞噬細(xì)胞能力和分泌干擾素的能力下降，整體免疫功能下降，導(dǎo)致免疫防御能力低下，易受感染、病變和衰老。脾臟中有T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，還有巨噬細(xì)胞，與體液免疫、細(xì)胞免疫均有密切關(guān)系，一些免疫增強(qiáng)劑可使胸腺和脾臟增重［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型給藥組胸腺和脾的重量與對(duì)照組接近，無顯著性差異(P＞0.05)，表明鳳尾草醇提物對(duì)胸腺和脾的功能狀態(tài)的良性影響，可改善機(jī)體的免疫功能。

4.5 本實(shí)驗(yàn)研究表明，不同劑量的鳳尾草醇提物均可以對(duì)抗小鼠腦組織氧自由基NO，從而起到延緩小鼠衰老的作用，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)，綜上所述，鳳尾草醇提物抗衰老作用的機(jī)制可能有:①通過對(duì)抗小鼠腦組織氧自由基NO、抑制NOS活性、清除自由基NO，阻斷自由基鏈鎖反應(yīng)，降低NO含量，發(fā)揮抗衰老作用。②鳳尾草醇提物通過對(duì)胸腺和脾臟等免疫器官功能狀態(tài)的改善，提高機(jī)體的免疫能力，增強(qiáng)機(jī)體的抗衰老作用。

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