王文躍 ，陳永勝 ，李國(guó)瑞 ，黃鳳蘭 ，尚雨絲 ，王 超 ，張智勇

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

蓖麻（Ricinus communis L.）屬大戟科蓖麻屬，是世界10大油料作物之一，對(duì)航天、航空、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工等行業(yè)都有突出的貢獻(xiàn)[1-7]。

目前，國(guó)內(nèi)外蓖麻優(yōu)良品種較少、研究水平較低，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因工程技術(shù)對(duì)蓖麻新品種開(kāi)發(fā)起到了積極的作用。Sujatha等[8]使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，首次獲得基因組中整合了外源基因的蓖麻植株；Malathi等[9]用與Sujatha等相同的方法將CryI Ab基因轉(zhuǎn)入蓖麻中，獲得抗擬尺蠖的蓖麻轉(zhuǎn)基因植株。國(guó)內(nèi)外對(duì)蓖麻基因組的研究較多，黃鳳蘭等[10]構(gòu)建了含有蓖麻毒蛋白A鏈基因的正義和反義重復(fù)表達(dá)載體，為獲得低毒乃至無(wú)毒蓖麻奠定了基礎(chǔ)；王亞等[11]通過(guò)ISSR擴(kuò)增技術(shù)建立了適合單雌蓖麻的反應(yīng)體系，為篩選單雌性狀相關(guān)基因提供技術(shù)支持。

轉(zhuǎn)基因蓖麻新品種獲得需要一套完整的遺傳轉(zhuǎn)化體系，且蓖麻較其他植物缺乏植株再生能力和極低的增殖率而使其快繁體系建立困難重重。適當(dāng)?shù)腜GR種類及濃度配比在植物生長(zhǎng)中起著積極的作用，能夠有效地加快蓖麻再生的效率。Sujatha等[12]發(fā)現(xiàn)，TDZ對(duì)叢生芽的形成有突出作用；張利明等[13]利用6-BA，有效地提高了外植體的芽增殖率；黃鳳蘭等[14]以ZT和NAA培養(yǎng)蓖麻子葉節(jié)，能有效地預(yù)防蓖麻子葉節(jié)玻璃化。

本研究在黃鳳蘭等[14]研究的基礎(chǔ)上，以蓖麻子葉節(jié)為外植體，設(shè)置不同質(zhì)量濃度的ZT和NAA，IAA，IBA處理農(nóng)桿菌浸染的蓖麻子葉節(jié)，探索蓖麻子葉節(jié)再生最適發(fā)芽與生根的激素質(zhì)量濃度，旨在建立蓖麻遺傳轉(zhuǎn)化中離體快繁體系。

1 材料和方法

1.1 試材與試劑

通蓖5號(hào)種子購(gòu)于通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)院；玉米素（ZT）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、瓊脂、乙酰丁香酮、卡那霉素均購(gòu)于Sigma公司；蔗糖、無(wú)水乙醇、升汞、MS培養(yǎng)基均購(gòu)于國(guó)內(nèi)公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)材料準(zhǔn)備 根據(jù)黃鳳蘭等[10]的研究，取當(dāng)年粒大、飽滿的蓖麻種子經(jīng)培養(yǎng)后，選淡黃色時(shí)期的子葉節(jié)預(yù)培養(yǎng)3 d，農(nóng)桿菌浸染10min（不斷地?fù)u動(dòng)農(nóng)桿菌菌液），再接到原培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)（一般為7 d）。

1.2.2 激素濃度篩選

1.2.2.1 誘導(dǎo)芽篩選

1.2.2.1.1 ZT和NAA不同質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)芽篩選 設(shè)ZT質(zhì)量濃度為0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mg/L，NAA質(zhì)量濃度為 0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/L，共36個(gè)處理，32顆材料，3次重復(fù)，記錄30d時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)。每升培養(yǎng)基：1/8 MS＋蔗糖20g＋瓊脂10g＋乙酰丁香酮5.00mg＋卡那霉素2.50mg，pH值為5.6～5.8。以相同質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)未進(jìn)行農(nóng)桿菌浸染的子葉節(jié)作為對(duì)照。

1.2.2.1.2 ZT和NAA低質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)芽最適篩選 根據(jù)1.2.2.1.1結(jié)果設(shè)定ZT質(zhì)量濃度為0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 mg/L，NAA 質(zhì)量濃度為 0，0.03 ，0.06，0.09，0.12，0.15 mg/L，共 42 個(gè)處理，40顆材料，3次重復(fù)，記錄30d時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)。每升篩選培養(yǎng)基：1/8 MS＋蔗糖20g＋瓊脂10g＋乙酰丁香酮5.00mg＋卡那霉素2.50mg，pH值為5.6～5.8。

1.2.2.2 誘導(dǎo)根篩選

1.2.2.2.1 NAA不同質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)根篩選

設(shè) NAA的質(zhì)量濃度為 0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30mg/L，共 7 個(gè)處理，30顆材料，3 次重復(fù)，記錄30d時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)。每升培養(yǎng)基：1/8 MS＋蔗糖20g＋瓊脂10g，pH值為5.6～5.8。

1.2.2.2.2 NAA，IAA，IBA低質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)根最適篩選 根據(jù)1.2.2.2.1結(jié)果設(shè)定NAA質(zhì)量濃度為 0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16 mg/L。IAA，IBA的質(zhì)量濃度梯度與NAA的質(zhì)量濃度梯度相同，35顆材料，3次重復(fù)，記錄30d時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)。每升篩選培養(yǎng)基：1/8 MS＋蔗糖20g＋瓊脂 10g，pH 值為 5.6～5.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)芽篩選結(jié)果

2.1.1 ZT和NAA不同質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)芽的初篩選結(jié)果 由表1可知，ZT的質(zhì)量濃度為0～2.0mg/L時(shí)的總芽誘導(dǎo)率明顯高于其他質(zhì)量濃度，所以，ZT的質(zhì)量濃度為0～2 mg/L時(shí)適宜蓖麻子葉節(jié)發(fā)芽；NAA的質(zhì)量濃度在0.15 mg/L以下時(shí)有助于芽誘導(dǎo)；農(nóng)桿菌浸染的子葉節(jié)對(duì)卡那霉素有抗性，其生長(zhǎng)狀態(tài)明顯要好于未浸染的子葉節(jié)。在此基礎(chǔ)上需要進(jìn)一步篩選，尋找更加適宜的蓖麻子葉節(jié)芽誘導(dǎo)的ZT與NAA質(zhì)量濃度配比。

表1 ZT和NAA不同質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)芽的初篩選

2.1.2 ZT和NAA低質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)芽的最適篩選結(jié)果 從表2可以看出，與初篩選結(jié)果一致，不添加NAA比添加NAA芽誘導(dǎo)率要高出許多，在處理編號(hào)為 1，3，7，13，25，31 中的芽誘導(dǎo)率與生長(zhǎng)狀態(tài)都要好于其他處理，其中，處理編號(hào)為31的更為突出，故只添加ZT且質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)，最有利于蓖麻子葉節(jié)芽的誘導(dǎo)（圖1-A）。

表2 ZT和NAA低質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)芽的最適篩選

2.2 誘導(dǎo)根篩選結(jié)果

2.2.1 NAA不同質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)根的初篩選結(jié)果 由表3可知，處理編號(hào)為1，3，4的根誘導(dǎo)率較高，且NAA質(zhì)量濃度在0～0.15 mg/L時(shí)的總根誘導(dǎo)率較其他質(zhì)量濃度高，且與未進(jìn)行農(nóng)桿菌浸染的子葉節(jié)處理相比，生長(zhǎng)狀態(tài)也較好，所以，低質(zhì)量濃度的NAA有助于蓖麻子葉節(jié)的根誘導(dǎo)。但此時(shí)的根誘導(dǎo)率較低，應(yīng)該篩選出更加適宜蓖麻子葉節(jié)誘導(dǎo)根的激素與激素質(zhì)量濃度，以求得到更多的轉(zhuǎn)化苗，提高蓖麻組織培養(yǎng)效率。2.2.2 NAA，IAA，IBA低質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)根的最適篩選結(jié)果 NAA，IAA和IBA不同質(zhì)量濃度組合最適篩選生根結(jié)果如表4所示。由表4可知，添加IBA的根誘導(dǎo)率要明顯好于添加NAA或IAA，則IBA為最適根誘導(dǎo)PGR；當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為0.10，0.16 mg/L時(shí)的根誘導(dǎo)率較高，且生長(zhǎng)狀態(tài)較好。但考慮到節(jié)省資源，則選IBA質(zhì)量濃度為0.10mg/L時(shí)最適根誘導(dǎo)（圖1-B）。

表3 NAA不同質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)根的初篩選

表4 NAA，IAA，IBA低質(zhì)量濃度配比誘導(dǎo)根的最適篩選

3 結(jié)論與討論

理想的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系應(yīng)該適合于各種基因型，這為蓖麻分子育種帶來(lái)了契機(jī)。通過(guò)建立蓖麻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，可以有效地提高蓖麻再生的速率，進(jìn)而縮短蓖麻培育新品種的年限。本試驗(yàn)在黃鳳蘭等[14]研究的基礎(chǔ)上，對(duì)影響蓖麻子葉節(jié)再生過(guò)程中，芽和根誘導(dǎo)的最適PGR種類及其質(zhì)量濃度進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，在只添加ZT且質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)最適芽的誘導(dǎo)；IBA為最適根誘導(dǎo)的PGR，其0.1 mg/L為蓖麻子葉節(jié)最適根誘導(dǎo)質(zhì)量濃度。農(nóng)桿菌浸染后的子葉節(jié)對(duì)卡那霉素具有抗性，這為子葉節(jié)再生后的篩選工作節(jié)省了工作時(shí)間。

本研究以蓖麻子葉節(jié)進(jìn)行離體初代培養(yǎng)，有利于誘導(dǎo)新芽，并且芽是直接從外植體的芽點(diǎn)處萌發(fā)產(chǎn)生的，此培養(yǎng)途徑有利于再生植株保持原母本的遺體性狀。以蓖麻子葉節(jié)為外植體，誘導(dǎo)生根的關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)在于，根系直接從皮層長(zhǎng)出，其整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中不產(chǎn)生愈傷組織，這種根系便于從基質(zhì)中吸收水分、養(yǎng)分，有利于再生苗的成活和生長(zhǎng)，同時(shí)也加大了在轉(zhuǎn)置土壤中的幾率。本試驗(yàn)對(duì)適宜蓖麻組織培養(yǎng)中PGR的種類及質(zhì)量濃度進(jìn)行了探討，為進(jìn)一步深入研究提供參考。

［1］張愛(ài)琳，王玉榮，陳勉華.脫毒蓖麻餅粕飼喂小鼠安全性試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（1）：85-86.

［2］Arslan G G，Eser I.An examination of the effect of castor oil packs on constipation in the elderly[J].Complement Ther Clin Pract，2011，17（1）：58-62.

［3］何恒果.蓖麻提取液對(duì)菜青蟲(chóng)的生物活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（15）：7929-7930.

［4］Sampieri B R，Arnosti A，Nunes P H，et al.Ultrastructural changes in the ovary cells of engorged Rhipicephalus sanguineus female ticks treated with esters of ricinoleic acid from castor oil（Ricinus communis）[J].Microsc Res Tech，2012，75（5）：683-690.

［5］Madhuri A，Nagaraju B，Harikrishna N，et al.Production of alkaline protease by bacillus alti-tudinis GVC11 using castor husk in solid-state fermentation [J].Appl Biochem Biotechnol，2012，167:1199-1207.

［6］Carmello J C，F(xiàn)ais L M，Ribeiro L N，et al.Diametral tensile strength and film thickness of an experimental dental luting agent derived from castor oil[J].J Appl Oral Sci，2012，20（1）：16-20.

［7］張樹(shù)軍，狄建軍，黃鳳蘭.以蓖麻酸（酯）為原料合成共軛亞油酸的研究進(jìn)展 [J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011（1）：62-64.

［8］Sujatha M，Sailaja M.Stable genetic transformation of castor（Ricinus communis L.）via agrobacterium-mediated gene transfer using embryo axes from mature seeds[J].Plant Cell Reports，2005，23：803-810.

［9］Malathi B，Ramesh S，RaoK V，et al.Agrobacterium-mediated genetic transformation and production of semilooper resistant transgenenic castor （Ricinus communis L.）[J].Euphytica，2006，147：441-449.

［10］黃鳳蘭，李國(guó)瑞，陳永勝.蓖麻毒蛋白A鏈基因克隆與重復(fù)表達(dá)載體構(gòu)建 [J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2009，31（6）：167-172.

［11］王亞，郭志強(qiáng)，王宏偉.單雌蓖麻ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：15-18.

［12］Sujatha M，ReddyT.Differential cytokinin effects on the stimulation of in vitro shoot proliferation from meristematic explants of castor （Ricinus communis L.）[J].Plant Cell Reports，1998，17：561-566.

［13］張利明，侯玲玲，李文彬.蓖麻組織培養(yǎng)和植株再生的研究[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2009，31（2）：253-255.

［14］黃鳳蘭，孟凡娟，李國(guó)瑞.預(yù)防組培中蓖麻子葉節(jié)玻璃化的研究[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2010，32（1）：139-143.