張 翼，穆 軍，董學(xué)偉，馮妍，毛銳濤，修志龍

(1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024;2.大連交通大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連116028)

0 引言

海洋微生物具有豐富的物種資源以及產(chǎn)生多樣化藥物活性先導(dǎo)化合物的巨大潛力，是近20年來海洋天然藥物研究的最熱點領(lǐng)域.在海洋微生物藥物研究中，挖掘現(xiàn)有菌種資源的藥用潛力與開發(fā)新的極端環(huán)境微生物資源是不可偏廢的兩個方面.對于前者來說，主要目標(biāo)是通過人為地干預(yù)來提高微量活性物質(zhì)的產(chǎn)量或促使菌株產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上更豐富多彩的新的活性化合物.事實上，很多微生物都具有豐富的沉默代謝途徑，有巨大的潛力可供挖掘.特別是在對于目標(biāo)化合物的生物合成途徑尚不明確的情況下，誘變育種其實是提高菌株性能的一個現(xiàn)實而有效的手段.目前關(guān)于陸地藥源微生物誘變育種的研究很多，手段豐富多樣，也有很好的效果，青霉素產(chǎn)量的巨大提高就是一個典型的例子，但海洋藥源微生物相關(guān)報道卻比較少.

等離子體誘變是近年出現(xiàn)的一種微生物誘變新技術(shù).等離子體是指由部分電子被剝奪后的原子及原子被電離后產(chǎn)生的正負(fù)電子組成的離子化氣體狀物質(zhì)，呈現(xiàn)出高度激發(fā)的不穩(wěn)定態(tài)，其中包含了多種理化誘變復(fù)合因素，而且常/低溫條件下產(chǎn)生的等離子體對生物材料熱致死效應(yīng)較小，因此可有效的引起基因突變，產(chǎn)生高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)或具有新性狀的新菌種，具有誘變機(jī)制獨特、誘變效率高、操作簡單、成本低、安全無污染等諸多優(yōu)點［1］.但迄今為止，尚未見到國內(nèi)外將等離子體用于海洋真菌等海洋藥源微生物育種研究的相關(guān)報道.

本文運用介質(zhì)阻擋放電大氣壓低溫等離子體技術(shù)對海洋真菌的等離子體誘變育種進(jìn)行了初步的探索研究，包括誘變方式、誘變條件、活性篩選方法及小規(guī)模的誘變處理效果研究.

1 實驗方法

1.1 材料、試劑與儀器

海洋真菌菌株：菌株AP2T1，殼青霉(Penicillium crustosum)，本實驗室分離自中國東海海域捕獲大白鯊鰓部.活性指示菌：DNA損傷修復(fù)基因缺陷的大腸埃希氏菌(Eschrichia coli AB3027，下文簡寫為DDRT(-)菌株)，購自美國耶魯大學(xué)大腸桿菌庫.

培養(yǎng)基：海洋真菌培養(yǎng)：海水馬鈴薯培養(yǎng)基(200 g土豆加入500 mL去離子水，煮沸15 min，紗布過濾得土豆汁，加去離子水定容至500 mL，加入天然粗海鹽配制過濾海水500 mL(40g/L)，蔗糖20 g，瓊脂20 g，121℃ 高壓滅菌15 min待用);大腸桿菌培養(yǎng)：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，牛肉膏 3 g，瓊脂 15 g，加入500 mL水，pH 7.2 ±0.2，121℃ 高壓滅菌15 min 待用).各種器材，高壓滅菌后使用.

輔助化學(xué)誘變劑：無水氯化鋰、5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫酸二乙酯.所用試劑均為分析純.

等離子體發(fā)生器(大連理工大學(xué)自加工儀器)，超凈工作臺(上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，恒溫?fù)u床(江蘇太倉式實驗設(shè)備廠)，CX-31型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，三用紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司).

1.2 單孢子懸液制備

將出發(fā)菌株AP2T1從菌種斜面接種海水馬鈴薯培養(yǎng)基(M-PSA)平板，于28℃培養(yǎng)2～3 d;從平板上挑取單菌落接種裝有150 mL M-PSA培養(yǎng)基的錐形瓶中，無菌透氣膜封口，于在28℃恒溫箱培養(yǎng)7～15 d，至產(chǎn)生大量孢子.向瓶中加入9 g/L的無菌生理鹽水，洗下孢子，轉(zhuǎn)移至裝有無菌玻璃珠的錐形瓶中，搖15～20 min，以分散孢子，使用無菌濾器過濾得單孢子懸液(濾器仿照文獻(xiàn)方法［2］，由塞有適量脫脂棉的移液槍頭、乳膠管、移液管順序連接而成，滅菌烘干后備用).孢子分散效果由顯微鏡檢檢驗.將上述單孢子懸液轉(zhuǎn)移到滅好菌的離心管中，用血球計數(shù)器計數(shù)并進(jìn)行梯度稀釋，將孢子濃度調(diào)至5×103個/mL.

1.3 等離子誘變處理方法

等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)如圖1所示［3］，不銹鋼腔體上裝有上下平板金屬電極，上電極被石英筒包覆，使用之前，先對操作間使用紫外滅菌30 min，等離子發(fā)生器開啟15 min滅菌，然后將需誘變的涂布有制備好的50 μL真菌單孢子懸液的培養(yǎng)基平板置于兩電極之間，兩電極間通有高壓電，其電極間距、電壓及放電頻率可調(diào)，當(dāng)電極間距、電壓、頻率達(dá)到臨界值時，兩電極間的空氣介質(zhì)就會被擊穿，產(chǎn)生等離子體放電現(xiàn)象，等離子體產(chǎn)生的復(fù)合誘變因素就會作用于真菌剛剛萌發(fā)的孢子，使其發(fā)生基因突變［3-4］.

圖1 介質(zhì)阻擋放電等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)示意圖

1.4 等離子放電條件探索

將準(zhǔn)備好的涂好有單孢子的平板，放入等離子體中使上電極與瓊脂的距離為3 mm，打開開關(guān)，調(diào)電壓示數(shù)為25(相當(dāng)于8 kV)，再調(diào)節(jié)頻率至臨界值，使等離子體剛好放電，固定頻率旋鈕，秒表到達(dá)誘變時間后，將電壓旋鈕調(diào)零，關(guān)閉電源，誘變時間設(shè)置如下：0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，7，8，9，10 min，每個時間點設(shè)兩個平行平板.誘變處理后，將平板于28℃倒置培養(yǎng)至長出菌落后計數(shù)，計算相應(yīng)時間點的致死率，即致死率(%)=(1-存活菌落平均數(shù)/未誘變的對照平板菌落平均數(shù))*100.

1.5 等離子體誘變方式比較

為研究菌株在單純等離子體誘變、等離子體與一種或兩種化學(xué)誘變劑復(fù)合誘變條件下的存活能力，并尋找致死能力適中的化學(xué)輔助誘變劑，設(shè)計如下表1所示試驗.即只使用等離子體對菌株進(jìn)行誘變試驗，或在培養(yǎng)集中預(yù)先添加一種或兩種化學(xué)誘變劑進(jìn)行輔助誘變，或在等離子體誘變之前對孢子懸液進(jìn)行化學(xué)誘變劑的預(yù)處理.為便于在同一天內(nèi)完成大量的誘變處理，每個時間點設(shè)置兩個平行，計算致死率.所用化學(xué)誘變劑的終濃度參照文獻(xiàn)用量，分別為：氯化鋰5 g/L［5-6］，5-FU 10 μg/mL［5-6］，硫酸二乙酯(DES)2%［7-8］.其中硫酸二乙酯的處理方法：在單孢子菌懸液中加入DES與50%的乙醇溶液混合，使DES的終濃度為2.0%，作用10 min后，加入1/2體積的25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)［7-8］.

表1 誘變條件比較試驗設(shè)計

1.6 等離子體誘變致死曲線

選取致死效應(yīng)適中的誘變條件，細(xì)化誘變時間設(shè)置，增加實驗重復(fù)，以研究等離子體誘變的致死曲線，為今后大規(guī)模誘變處理選擇最適條件.分別為單純等離子體誘變，時間點設(shè)置為10，20，30，40，50，60，90，120，150 s;等離子體 - 氯化鋰復(fù)合誘變，時間點設(shè)置為 10，20，30，40，50，60 s.

1.7 誘變菌株篩選方法

誘變菌株的活性篩選采用初篩與復(fù)篩相結(jié)合的方法［9］.以E.coli DDRT(-)菌株為指示菌，將菌種于37℃活化傳兩代，用無菌生理鹽水洗下第二代菌體，并稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋⌒迈r配制的菌液100 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，備用.

初篩采用平板瓊脂塊擴(kuò)散法：將誘變平板上的存活菌落一一編號，用無菌牙簽接種小斜面保藏菌種，并同時接種到新的M-PSA平板上.在平板上28℃培養(yǎng)7天后，用無菌打孔器切下菌落，轉(zhuǎn)移到上述涂布有DDRT(-)指示菌的營養(yǎng)瓊脂平板上，正置于4℃冰箱中擴(kuò)散一夜，第二天取出置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果.

采用搖瓶培養(yǎng)-濾紙片法：將初篩活性菌株接種到盛有100 mL海水馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(同上M-PSA固體培養(yǎng)基成分，但不含瓊脂)的250 mL三角燒瓶中，無菌透氣膜封口，28℃下180 r/m轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)5天，再加入50 mL乙酸乙酯振蕩過夜殺菌，抽濾，濾渣加入50 mL甲醇，超聲提取1h.濾液分層分離得乙酸乙酯相，再每次加入50 mL乙酸乙酯萃取兩遍，將兩種提取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，并合并得到總粗提物，蒸干.加入2 mL甲醇溶解樣品，轉(zhuǎn)移入置于小瓶中待測活.取20 μL提取物加于5 mm直徑厚濾紙片，晾干后貼放到上述涂布有指示菌的平板上，同樣方法測定抑菌圈直徑，每個樣品測三個平行，取平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 等離子放電條件探索

試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)入x子體發(fā)生器的上平板電極與瓊脂的距離為3 mm，電壓為8 kV，頻率調(diào)節(jié)至5.0 kHz時等離子體發(fā)生器達(dá)到臨界狀態(tài)，可觀察到藍(lán)色的火花狀等離子體放電現(xiàn)象.由于過強的等離子體致死效應(yīng)太強，故本實驗中采用了最低的臨界電流值，使等離子體強度維持在最低狀態(tài)，而主要通過放電作用時間來調(diào)節(jié)誘變劑量.在本實驗條件下，發(fā)現(xiàn)當(dāng)放電時間超過5 min時，孢子存活率都接近于零(圖2).故下面的試驗中主要研究了不同條件下較短放電時間內(nèi)的效果，并縮短了時間間隔.

圖2 初步放電條件摸索

2.2 等離子體誘變方式比較

試驗發(fā)現(xiàn)化學(xué)誘變劑5-FU、DES在當(dāng)前劑量下致死作用過強，無論單獨使用或是與等離子體、等離子體-其他化學(xué)誘變劑復(fù)合使用，在所有時間點的平板上均未發(fā)現(xiàn)存活菌落，而在更低劑量下它們或許也可作為本菌株的輔助誘變劑，這有待深入考察;而氯化鋰本身未表現(xiàn)出明顯致死效應(yīng)性，添加0.5%氯化鋰的對照平板與普通的MPSA對照平板均生長有數(shù)量相近的大量菌落(約200個).等離子體單獨誘變與等離子體-氯化鋰復(fù)合誘變對菌株AP2T1有較適中的致死效應(yīng)，其在90 s內(nèi)致死率小于100%(圖3)，可能是較適合該菌株的誘變條件.另外，從形態(tài)上看，等離子體-氯化鋰復(fù)合誘變的存活菌落普遍要比對照菌及等離子體單獨誘變的存活菌落小(圖4)，這表明復(fù)合誘變可能對菌株具有不同的誘變機(jī)制.為繪制這兩種誘變條件較精確的致死曲線，下面的試驗中進(jìn)一步在90 s內(nèi)設(shè)置了間隔更短的時間點，并每個時間點的平行試驗增至5個.

圖3 不同誘變條件的粗略致死曲線

圖4 菌株AP2T1等離子體、等離子體-LiCl誘變平板

2.3 等離子體誘變致死曲線

誘變劑量通常用致死率來衡量，因此致死曲線的研究對于尋找合適的誘變劑量非常重要.精確試驗表明，對于菌株AP2T1，等離子體單獨誘變和等離子體-氯化鋰復(fù)合誘變分別在15～55 s、35～55 s作用時間范圍內(nèi)可達(dá)到合適的致死率，即被普遍接受的較適宜誘變育種的75%～85%的致死率(圖4);而且它們的致死曲線在高致死劑量呈現(xiàn)小的飽和峰現(xiàn)象，即在一定時間(劑量)范圍內(nèi)，隨著時間(劑量)的增加，致死率會出現(xiàn)先升-降-升的波動，與前人報道的細(xì)菌等離子體誘變規(guī)律相似［4］，說明絲狀真菌的孢子在等離子體誘變達(dá)到一定劑量時也會激活其細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制，以降低致死率，但隨著誘變劑量進(jìn)一步提高修復(fù)機(jī)制不足以抵抗致死因素時，致死率會進(jìn)一步升高.而且等離子體單獨誘變與等離子體-氯化鋰復(fù)合誘變的致死曲線飽和峰的數(shù)量、位置也有差異，這可能從另一方面也揭示了這兩種誘變方式可能存在有差異的機(jī)制.

圖5 菌株AP2T1等離子體誘變致死曲線

2.4 誘變菌株篩選

本實驗中采用了一株具有DNA損傷修復(fù)基因缺陷型的特殊大腸桿菌作為指示菌，該指示菌對于基于DNA損傷機(jī)制的抗腫瘤、抗菌藥物比較敏感，是一種方便高效的篩選指示模型［10-11］.對2.2中等離子體單獨誘變、等離子體-氯化鋰復(fù)合誘變得到的300余個存活菌落進(jìn)行了拮抗DDRT(-)指示菌的活性篩選，并以同期培養(yǎng)的未誘變菌落作為初篩對照(表2).發(fā)現(xiàn)在300余個存活菌落中有一個單純等離子體誘變得到的菌落D-5-D-23顯示了較顯著的抑菌圈，其圈與菌落瓊脂塊本身直徑之比可達(dá)3;而用作對照的未誘變菌落(同時也是出發(fā)菌株)可能因為在三角瓶中產(chǎn)孢培養(yǎng)時間過長，接近15天，導(dǎo)致原菌株的孢子過老或因積累有害代謝產(chǎn)物發(fā)生衰變，導(dǎo)致菌株退化，故原菌對照活性較弱，圈/菌塊直徑比只有1.7.這表明等離子體確實可能激活了出發(fā)菌株中已經(jīng)衰退的活性物質(zhì)代謝途徑，具有復(fù)蘇作用.將該突變株與新鮮培養(yǎng)的出發(fā)菌株同時接種海水馬鈴薯液體培養(yǎng)基搖床發(fā)酵五天后，用有機(jī)溶劑提取得到的總粗提物都顯示了對于DDRT(-)指示菌的抑制活性，而且突變菌株的活性相對于出發(fā)菌株確有增強.

表2 活性突變株活性篩選

可能因為本次初步小規(guī)模試驗采用的孢子培養(yǎng)過老，導(dǎo)致菌種退化，也因此弱化了誘變菌株的產(chǎn)活性物質(zhì)基礎(chǔ);另外由于此次工作規(guī)模的限制，并沒有以最佳誘變劑量進(jìn)行大規(guī)模的誘變處理和菌株篩選工作，這些原因使得誘變效果并非特別理想，但上述結(jié)果仍顯示等離子體的確可以激活該海洋真菌菌株衰退的代謝潛力，增強其生物活性.

3 結(jié)論

誘變育種是培育優(yōu)良菌種的有效手段，海洋微生物是富有潛力的海洋藥物可持續(xù)利用資源，而目前對于海洋藥源微生物的誘變育種研究工作國內(nèi)外均處于起步階段，等離子體技術(shù)在育種方面具有誘變效率高、操作簡單、安全廉價等優(yōu)點，目前尚未見到該技術(shù)用于海洋藥源微生物育種的研究報道.

本文建立了一套用于海洋藥源真菌單孢子誘變育種的研究方法，包括等離子誘變條件、方式和合適劑量的探索，發(fā)現(xiàn)在15(或35)～55 s時間劑量內(nèi)的等離子體單獨誘變和等離子體-氯化鋰復(fù)合誘變比較適合該菌株的誘變，等離子體誘變對于已衰退出發(fā)菌株具有活性代謝途徑的激活作用.在實驗中還采用了較方便的真菌單孢子平板直接誘變-篩選的方法，與傳統(tǒng)的單孢子懸液誘變處理后再涂布平板分離菌落后篩選的方法相比，簡化了工作環(huán)節(jié)、減輕了篩選的工作量;另外采用了一株具有DNA損傷修復(fù)基因缺陷的特殊大腸桿菌作為指示菌，有利于方便高效的追蹤指示真菌代謝產(chǎn)物中的潛在抗腫瘤抗菌活性物質(zhì)，這些方法也具有一定的新意.綜上所述，本文為等離子體誘變技術(shù)用于海洋藥源真菌育種的首例報道，其研究結(jié)果表明該技術(shù)作為一種較新穎的微生物育種技術(shù)，在海洋微生物藥物研究方面具有很好的應(yīng)用前景.當(dāng)然，由于誘變育種工作工作量繁重，作為初步研究，本文在誘變條件及大規(guī)模誘變篩選方面還有待繼續(xù)進(jìn)行深入細(xì)致的工作.

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