苑玉和，吳苗苗，劉 巖，胡金鳳，王宏旭，陳乃宏

(天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，中國醫(yī)學科學院藥物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100052)

核轉錄因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種廣泛表達并發(fā)揮重要作用的轉錄因子，具有調(diào)控細胞存活、增殖、分化等功能。因在最初發(fā)現(xiàn)的時候能與免疫球蛋白的輕鏈(κ鏈)增強子結合并具有轉錄激活活性而命名。因其能夠參與多種基因的轉錄調(diào)控，與炎癥反應、免疫應答，以及細胞的增殖、轉化和凋亡等重要的生理病理過程密切相關。目前對于NF-κB活性的檢測多通過免疫印跡、免疫熒光或報告基因的方法，但上述檢測方法中由于樣品的準備過程比較繁瑣，而且樣品不易保存，更重要的是不能夠觀察活細胞的狀態(tài)，因此建立一種能夠快速、簡易觀察NF-κB活性的方法對于NF-κB相關通路的研究具有重要的意義。本文將通過構建NF-κB中的p65與綠色熒光蛋白的融合載體，轉染不同的細胞后，建立顯微鏡下直接觀察NF-κB核轉位的細胞模型，對相關化合物的篩選與機制研究具有重要意義。

1 材料

BV-2(小膠質(zhì)細胞)、PC12(大鼠嗜鉻細胞瘤)購自中國醫(yī)學科學院基礎所細胞中心，菌株E.coli DH5α為本室保存;真核表達質(zhì)粒pEGFP-C1來自Clontech公司。TRIzol購自Amresco，TANScript M-MLV逆轉錄酶購自天根公司，Taq酶、dNTPs、核酸內(nèi)切酶XhoI、EcoRI和T4 DNA連接酶購自大連寶生物有限公司和Biolab公司，RNase A、Hochest33342購自Sigma公司，DNA MarkerⅡ購自鼎國生物有限公司。核酸純化試劑盒、質(zhì)粒大提試劑盒購自威格拉斯生物有限公司。所有細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司，實驗耗材購自Corning公司。其他試劑為國產(chǎn)或進口分析純試劑。共聚焦顯微鏡是Leica公司的TCS SP2。

2 方法

2.1 RT-PCR 取小鼠腦組織1 mg，生理鹽水洗2遍，加入TRIzol后，移入EP管中，加入氯仿，振蕩、靜置并離心，取上清;加入異丙醇，離心，棄上清;加入75%乙醇洗滌沉淀。晾干后加入DEPC H2O溶解，得到RNA。以獲得的mRNA為模板，Oligo(dT)16為引物，逆轉錄酶TIANScrip M-MLV合成第一鏈。以獲得的cDNA為模板，引物兩端加入XhoI/EcoRI

酶切位點，引物序列如下:正義鏈:5'CCGCTCGAGCTATGGACGATCTGTTTCCCCTC 3';反義鏈:5'CGGAATTCACCTTAGGAGCTGATCTGAC 3'。具體反應條件:94℃預變性4 min;94℃變性60 s;58℃退火60 s;72℃延伸90 s;擴增30個循環(huán)。利用核酸提取試劑盒純化擴增的基因片斷(方法參照說明書)。

2.2 pEGFP-C1-p65的構建及鑒定 T4DNA連接酶連接經(jīng)XhoI/EcoRI消化后的基因片斷和載體，16℃過夜連接后轉化大腸桿菌DH5α，卡那霉素(Kan+)篩選得到的克隆經(jīng)培養(yǎng)擴增后，提取質(zhì)粒經(jīng)XhoI/EcoR酶切，獲得的陽性克隆送測序。

2.3 pEGFP-C1-p65在不同細胞中的表達 利用試劑盒提取測序正確的質(zhì)粒，用于細胞轉染。將PC12或BV-2細胞接種至已包被的玻片或 confocal皿，24 h后利用LipofectimeTM2000進行轉染。轉染后24 h提取全細胞可溶性蛋白，通過Western blot方法確認p65的表達。

2.4 GFP-p65在不同細胞中核轉位的情況 按照“2.3”方法轉染BV-2細胞和PC12細胞，轉染24 h后，BV-2細胞給予LPS(100 μg·L－1)，孵育8～24 h后，可直接通過共聚焦顯微鏡觀察。

3 結果

3.1 成功構建pEGFP-C1-p65融合載體 提取Kana+篩選菌株的質(zhì)粒，電泳質(zhì)粒的XhoI/EcoRI酶切產(chǎn)物，在1 600 bp附近發(fā)現(xiàn)有特異性條帶，與PCR產(chǎn)物大小一致(Fig 1)。同時測序結果也表明鼠源p65基因片斷成功插入載體pEGFP-C1。

Fig 1 p65 recombinant vectors digested by XhoI/EcoRI

3.2 Western blot法檢測GFP-p65在BV-2細胞中的表達

過表達p65細胞株裂解的總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，分別加入anti-p65和anti-GFP抗體進行免疫印跡，在分子質(zhì)量90 ku均有特異性條帶。該條帶為GFP-p65融合蛋白，是轉染后表達的外源性蛋白，對照組(僅轉染pEGFP-C1)中在該分子質(zhì)量處則無明顯條帶;而作為內(nèi)參的β-actin的表達量是一致的(Fig 2)，由此表明模型組中p65的表達量明顯增加。

Fig 2 p65 expression increased in transgenic model

3.3 LPS能夠誘導BV-2細胞中的p65發(fā)生核轉位 LPS是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分，在免疫應答研究中常被作為一種多克隆免疫激發(fā)劑來模擬機體免疫激發(fā)狀態(tài)，是研究炎癥反應常用的試劑。研究發(fā)現(xiàn)(Fig3 A)轉染空載體pEGFP-C1后，熒光蛋白在全細胞表達，而轉染pEGFP-C1-p65后熒光蛋白主要在細胞質(zhì)表達，細胞核內(nèi)未出現(xiàn)熒光蛋白。而給予LPS刺激轉染pEGFP-C1-p65的BV-2細胞后，綠色熒光蛋白標記的p65則發(fā)生核轉位的現(xiàn)象(Fig 3 B)。

Fig 3A GFP-p65 overexpressed in BV-2 cells

Fig 3B GFP-p65 in BV-2 cells translocated into nucleus when BV-2 cells were exposed to LPS

3.4 GFP-p65在PC12細胞中的表達 NF-κB不僅作為重要的轉錄因子參與炎癥反應，同時也能夠調(diào)控神經(jīng)元的存活與死亡。將pEGFP-C1-p65轉染PC12細胞后，GFP-p65融合蛋白在有的細胞中主要分布在胞質(zhì)中，而在有的細胞中同時分布與細胞核中(Fig 4)，這種分布形式不同于在BV-2細胞的表達，這表明p65在神經(jīng)元中表達的不均一性。

Fig 4 GFP-p65 overexpressed in PC12 cells

4 討論

NF-κB是真核細胞轉錄因子Rel蛋白質(zhì)家族成員，包括5種:NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA(p65)、RelB和C-Bel。其中哺乳動物最多見的NF-κB因子是由p50和 p65兩個多肽組成的異源二聚體，它在細胞內(nèi)相對穩(wěn)定表達，是最主要的可以被誘導的二聚體。在NF-κB的異源二聚體中，雖然兩種亞單位均能與DNA結合，但只有p65蛋白的C-末端含有轉錄激活區(qū)域，能直接作用于靶基因而激活轉錄。因此目前可通過檢測p65的表達、分布的改變評價NF-κB活性的變化。基于上述原理，本文通過PCR的方法獲得p65基因，與綠色熒光蛋白(GFP)的基因融合后，構建能夠在哺乳動物細胞中表達的融合載體，通過綠色熒光蛋白的指示，在顯微鏡下直接觀察p65的表達與分布，尤其是核轉位的情況，由此可更直接觀察NF-κB轉錄因子活性的變化。

靜止狀態(tài)下，NF-κB以非活性形式存在于胞質(zhì)中，當細胞受炎癥、感染、損傷或應激等刺激后激活NF-κB［1］，使NF-κB快速易位進入核內(nèi)，與靶基因κB位點結合，迅速誘導靶基因的轉錄［2］。NF-κB廣泛分布于幾乎所有的組織和細胞中，通過影響靶基因的表達調(diào)控而影響細胞的功能。由于調(diào)節(jié)靶基因的不同，因而NF-κB發(fā)揮的功能也明顯不同。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，NF-κB同樣發(fā)揮著重要的作用，參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并與腦缺血、腦損傷等疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病密切相關［3－4］，因此有學者提出NF-κB可作為治療神經(jīng)退行性疾病的靶點［5］。

在免疫系統(tǒng)中能夠激活NF-κB的刺激在神經(jīng)系統(tǒng)中同樣能夠發(fā)揮作用。BV-2細胞是來源于小鼠的小膠質(zhì)細胞系，利用該細胞系能夠進行神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的相關研究。近幾年的研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與多種疾病關系密切，尤其與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分［6］。研究表明給予LPS刺激BV-2細胞，能夠激活NF-κB信號傳導通路［7］，而在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)利用LPS刺激小膠質(zhì)BV-2細胞，GFP-p65能夠發(fā)生核轉位的情況，由此表明觀察基于綠色熒光蛋白與p65融合蛋白的的核轉位情況，可研究膠質(zhì)細胞中NF-κB活性的改變，由此對神經(jīng)炎癥相關的問題進行研究。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，NF-κB不僅能夠調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞的功能，同時對神經(jīng)元存活、死亡、分化及突觸可塑性方面發(fā)揮著至關重要的作用［8］。多種因素能夠調(diào)控在神經(jīng)元中NF-κB的活性，其中包括神經(jīng)營養(yǎng)因子，如NGF能夠通過受體激活NF-κB［9］，對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用，同時對調(diào)控突觸可塑性也具有重要的意義。

GFP-p65在PC12中表達，在不同的細胞中其亞細胞定位并不相同，在有的細胞中僅在胞質(zhì)中表達，而有的也同時存在于細胞核中，呈現(xiàn)細胞表達的不均一現(xiàn)象。由此說明對于同一種刺激，不同的細胞反應并不完全相同，這可能與細胞所處的周期或狀態(tài)不同有關。

目前已成功建立p65轉基因細胞模型，為以NF-κB為靶點的創(chuàng)新藥物研制提供了良好的研究平臺，同時基于NF-κB對神經(jīng)元的保護功能及對突觸可塑性的調(diào)節(jié)功能，觀察GFP標記的p65可對某些作用于神經(jīng)元的創(chuàng)新藥物的作用機制進行深入的研究。

［1］ Pahl H L.Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors［J］.Oncogene，1999，18(49):6853－66.

［2］ Hayden M S，Ghosh S.NF-κB in immunobiology［J］.Cell Res，2011，21(2):223－44.

［3］ Memet S.NF-kappaB functions in the nervous system:from development to disease［J］.Biochem Pharmacol，2006，72(9):1180－95.

［4］ 李震徐，新 穎，沈 衛(wèi)，郭云良.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血/再灌注損傷NF-κB和I-κB的干預作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(1):52－6.

［4］ Li Z X，Xin Y，Shen W，Guo Y L.The interferring effects of picrosideⅡon the expressions of NF-κB andⅠ-κB following cerebral ischemia reperfusion injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):52－6.

［5］ Camandola S，Mattson M P.NF-kappa B as a therapeutic target in neurodegenerative diseases［J］.Expert Opin Ther Targets，2007，11 (2):123－32.

［6］ Brown G C，Neher J J.Inflammatory neurodegeneration and mechanisms of microglial killing of neurons［J］.Mol Neurobiol，2010，41 (2－3):242－7.

［7］ Svensson C，F(xiàn)ernaeus S Z，Part K，et al.LPS-induced iNOS expression in Bv-2 cells is suppressed by an oxidative mechanism acting on the JNK pathway-a potential role for neuroprotection［J］.Brain Res，2010，1322(31):1－7.

［8］ Mattson M P，Meffert M K.Roles for NF-kappaB in nerve cell survival，plasticity，and disease［J］.Cell Death Differ，2006，13(5): 852－60.

［9］ Carter B D，Kaltschmidt C，Kaltschmidt B，et al.Selective activation of NF-κB by nerve growth factor through the neurotrophin receptor p75［J］.Science，1996，272(5261):542.