董源，湯靈玲，林林，盧山

南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇省分子醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046

蛋白質(zhì)定量檢測是生命科學(xué)研究領(lǐng)域廣泛涉及的重要生物化學(xué)分析內(nèi)容。多年以來，盡管有先進(jìn)的蛋白檢測方法如質(zhì)譜、熒光分析等[1-2]在不斷發(fā)展，而福林酚試劑 (Folin-Ciocalteu’s reagent)、二辛可寧酸 (Bicinchoninic acid，BCA)和考馬斯亮藍(lán) G-250 (Coomassie brilliant blue G-250，CBB，也被稱作Bradford) 等仍然是最常規(guī)使用的比色測定方法[3]。這些方法是利用氧化還原反應(yīng)產(chǎn)物或者染料-蛋白質(zhì)絡(luò)合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度間存在的線性關(guān)系而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定樣品中可溶性蛋白濃度的，但在實(shí)際應(yīng)用中，常常會因?yàn)槎喾N化學(xué)物質(zhì)干擾而影響檢測結(jié)果，導(dǎo)致使用局限[4]。

例如，福林酚試劑法會受到表面活性劑、金屬離子螯合劑、還原劑及含氮化合物[5-6]等的嚴(yán)重干擾；BCA方法雖然受表面活性劑影響小，但對金屬離子螯合劑、還原劑等的存在很敏感[5]；CBB法與福林酚試劑法類似，對表面活性劑的耐受性差[7]，所以這些方法總會因?yàn)榈鞍踪|(zhì)測定液中非蛋白組分的存在而影響蛋白質(zhì)含量的精確測定，具體使用時，通常需要針對不同的干擾物質(zhì)選用不同的測定方法。如果蛋白液中存在表面活性劑，可以選用BCA方法檢測蛋白質(zhì)含量；而蛋白溶液中含有金屬離子螯合劑，就需要替換為CBB法檢測蛋白質(zhì)含量。這樣，不僅給蛋白質(zhì)含量檢測帶來操作上的不便，也使得不同溶液中蛋白質(zhì)含量的比較分析成為困難，還可能對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性產(chǎn)生影響，因此，人們總希望能夠找到好方法解除干擾。有研究針對某些特定的樣品如骨骼肌[8]，或某些特定操作如聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳[9]，探討適宜的檢測方法；也有文獻(xiàn)報道，通過檢測850 nm吸收值對CBB法進(jìn)行藥液蛋白質(zhì)含量分析中羧乙烯聚合物 (Carbopol) 產(chǎn)生的干擾進(jìn)行校正[10]；而含糖蛋白溶液則可以通過蛋白質(zhì)沉淀又溶解的方法來去除糖分導(dǎo)致的干擾[11]等；但迄今為止，對于多種常見的干擾物質(zhì)并沒有很好的解決辦法，所以開發(fā)簡便的受多種干擾物質(zhì)影響小的蛋白質(zhì)定量檢測方法十分必要。

本研究在廣泛使用的福林酚試劑法[12]的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計制定實(shí)驗(yàn)試劑的組成與配比以及操作程序，建立蛋白質(zhì)檢測新方法的同時又探討新方法發(fā)色產(chǎn)物的優(yōu)選檢測波長以及穩(wěn)定性，還分析新方法對多種常見干擾物質(zhì)的包容性，能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)的快速準(zhǔn)確定量提供方便。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin，BSA)、苯甲基磺酰氟 (Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) 從Sigma公司購入，蛋白酶抑制劑混合物 (Protease inhibitor cocktail，PIC) 購自Roche公司。聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100)、?-巰基乙醇 (?-Mercaptoethanol，?-ME)和乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·Na2，EDTA) 購自Amresco公司。二硫蘇糖醇 (Dithiothretol，DTT)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 (Ethylene glycol bis (2-aminoethyl) tetraacetic acid，EGTA)、硫酸銨(Ammonium sulfate，(NH4)2SO4) 和尿素 (Urea)購自Bio Basic公司。福林酚試劑由上海荔達(dá)生物科技公司出品。細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清 (Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為PAA Laboratories公司生產(chǎn)，低限基本培養(yǎng)基 (Minima essential medium，MEM) 粉末購自GIBCO公司。十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、釩酸鈉 (Na3VO4)等其他常用試劑購自國藥集團(tuán)。

1.1.2 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo Scientic公司)，酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司)，小型渦旋器。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

稱取一定量 BSA溶解于蒸餾水中，調(diào)配終濃度為4 g/L，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動物細(xì)胞裂解液的制備及干擾物質(zhì)的添加

細(xì)胞全蛋白待測樣品是通過裂解液收集、破碎細(xì)胞而獲取的上清液[13]，因此細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測定中的非蛋白干擾物質(zhì)主要來源于裂解液組分 (細(xì)胞體積可忽略不計)，細(xì)胞裂解液里添加的干擾成分的含量即為待測樣品干擾物質(zhì)的濃度。首先制備 10倍基本裂解液 (200 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，1.5 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA和10% SDS)，保存于-20 ℃。使用前冰上稀釋，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分別添加不同含量的各種干擾組分如DTT或者β-ME等，以及1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF和1×PIC。當(dāng)討論表面活性劑對蛋白測定的干擾時，基本裂解液組成不包含SDS，而各表面活性劑濃度按照具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計要求添加。

1.2.3 動物細(xì)胞培養(yǎng)及全蛋白提取

將 1.5×106人前列腺癌細(xì)胞 PC-3接種于10 mL含5% FBS-MEM培養(yǎng)基的100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，在5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，生長至50%飽和以上時，用4 ℃預(yù)冷的PBS(-)洗滌2次后，加入500 mL預(yù)冷的PBS (-)，然后用刮棒冰上收集細(xì)胞，并平均分配細(xì)胞液于1.5 mL離心管，4 ℃、10 000×g離心10 min，去上清，再移入包含不同成分的細(xì)胞裂解液，渦旋振蕩，放置冰上30 min，重復(fù)離心操作，收集上清液用于蛋白質(zhì)含量測定，也可以放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蛋白定量新方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別配制A貯存液 (含1.89 mol/L碳酸鈉和1 mol/L 氫氧化鈉)，B貯存液 (含0.25% 酒石酸鈉 (W/V)、0.125% 硫酸銅 (W/V) 和 2.5% SDS (W/V)) 及C發(fā)色液 (為2 mol/L福林酚原液的10倍稀釋液，用HCl調(diào)整pH至1) 于室溫下存放。

將 BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液按照二倍稀釋法用蒸餾水稀釋至最低濃度為0.0625 g/L的7個梯度濃度，分別取5 mL BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液各梯度樣品放入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；每個標(biāo)準(zhǔn)樣品至少有3個重復(fù)樣，空白對照為同體積的蒸餾水；然后加入25 mL工作液 (臨用前混合50個體積A貯存液與1個體積B貯存液)。再加入200 mL發(fā)色液，混合均勻，室溫下放置 30 min，利用酶標(biāo)儀在570~630 nm范圍任一波長下測定吸光值。獲取數(shù)值后輸入Excel軟件，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，縱坐標(biāo)為對應(yīng)吸光值，然后添加趨勢線，獲得線性回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)。另外，將標(biāo)準(zhǔn)樣品連續(xù)放置0.3、1、2、4、8、24 h后在630 nm波長下檢測吸光值，用于比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性。

1.2.5 蛋白定量新方法對干擾物質(zhì)的耐受性分析

進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)的同時，將與標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液同樣體積的0.1~4 g/L濃度區(qū)間的細(xì)胞蛋白樣品也加入96孔板中，每個待測樣品至少有3個重復(fù)樣；然后每個樣品添加25 mL工作液，最后加入 200 mL發(fā)色液，混合均勻，室溫下放置30 min，利用酶標(biāo)儀在590 nm波長下測定吸光值。獲得數(shù)值后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲取線性回歸方程，再將待測樣品吸光值導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 不同吸收波長下的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線和發(fā)色產(chǎn)物穩(wěn)定性的比較

以 BSA為標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別在 570、595或630 nm波長下繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其相應(yīng)的線性相關(guān)系數(shù)平方 (R2) 值分別為 0.998、0.998或 0.997，均大于通常標(biāo)準(zhǔn)曲線要求的 R2值 (0.996)[14]，說明用該標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所求的回歸方程是有意義的，且在上述波長范圍均可用作新方法的檢測波長，其中595 nm處獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光值最大，為優(yōu)選波長。此外，630 nm波長下最高濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光值隨時間變化的曲線如圖2所示，可以看出4 h內(nèi)幾乎沒有變化，8 h后下降約1.8%，24 h后下降14%，說明新方法獲得的發(fā)色產(chǎn)物在數(shù)小時內(nèi)顏色基本能夠保持恒定。

2.2 表面活性劑對細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測定的影響

細(xì)胞裂解液中 SDS含量不斷上升時，新方法對蛋白質(zhì)濃度測量結(jié)果見圖3A。SDS含量即使高達(dá)10%，細(xì)胞全蛋白濃度也幾乎沒有變化。

圖1 蛋白質(zhì)定量檢測的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 BSA standard curves for protein assay.

圖2 發(fā)色產(chǎn)物最大吸光值24 h內(nèi)的變化Fig. 2 Time course for maxi-Absorbances during 24 h.

圖3 表面活性劑存在下細(xì)胞全蛋白含量的檢測Fig. 3 Protein assay for cell lysates in the presence of 3 surfactants, respectively. (A) Lysis buffer containing SDS. (B) Lysis buffer containing NP-40 or TritonX-100.

如果采用其他的常用表面活性劑TritonX-100或 NP-40來處理細(xì)胞，則蛋白質(zhì)濃度測量結(jié)果的變化見圖3B，當(dāng)TritonX-100含量小于或等于1%，NP-40含量小于或等于2%，對蛋白定量沒有明顯的影響。

2.3 金屬離子螯合劑對細(xì)胞全蛋白定量的影響

不同濃度金屬離子螯合劑EDTA或EGTA存在下，新方法對細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度的檢測結(jié)果如圖4所示，50 mol/L EDTA使蛋白質(zhì)濃度顯著降低，而2 mmol/L EGTA使蛋白質(zhì)濃度下降了42%。但是EDTA與EGTA濃度分別為25 mmol/L或1 mmol/L及以下則對蛋白質(zhì)檢測沒有明顯干擾。

圖4 金屬離子螯合劑存在下全蛋白含量的檢測Fig. 4 Protein assay for cell lysates in the presence of chelators, respectively. (A) EDTA. (B) EGTA.

2.4 還原劑對細(xì)胞全蛋白定量的影響

新方法對含有不同濃度DTT或β-ME的細(xì)胞蛋白裂解液進(jìn)行的定量測定結(jié)果見圖5，可以看出樣品溶液中包含DTT或β-ME在1 mmol/L及以下對蛋白質(zhì)濃度檢測沒有顯著影響。

圖5 還原劑存在下全蛋白含量的檢測Fig. 5 Protein assay for cell lysates in the presence of reductants, respectively. (A) DTT. (B) β-ME.

2.5 含氮物質(zhì)對細(xì)胞全蛋白定量的影響

常用的含氮物質(zhì)硫酸銨和尿素存在時，細(xì)胞蛋白定量的結(jié)果如圖 6所示，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨含量小于或等于0.5 mol/L，或尿素含量小于或等于 4 mol/L 對蛋白質(zhì)檢測不會造成顯著干擾。

圖6 含氮化合物存在下全蛋白含量的檢測Fig. 6 Protein assay for cell lysates in the presence of nitrogen-containing compunds, respectively. (A) (NH4)2SO4. (B) Urea.

3 討論

福林酚試劑法是1951年Lowry等[15]在雙縮脲反應(yīng)基礎(chǔ)上，引入福林酚試劑來擴(kuò)大反應(yīng)信號的蛋白質(zhì)含量檢測方法，因此又被稱作 Lowry法。主要依據(jù)是利用堿性條件下Cu2+與肽骨架的-CO-NH-基團(tuán)形成的藍(lán)色絡(luò)合物將鱗鎢酸和鱗鉬酸還原為鎢和鉬藍(lán)而進(jìn)一步呈色的結(jié)果[16]。常用的試劑組成如表1所示，首先使蛋白質(zhì)樣品置于堿性環(huán)境，然后與CuSO4試劑混合，室溫放置約15 min，再加入福林酚試劑放置45 min，660 nm波長下測定吸光值。此方法的主要缺點(diǎn)是對許多干擾物質(zhì)的包容性差，如表面活性劑TritonX-100或 SDS含量僅達(dá)1%，金屬離子螯合劑EDTA濃度達(dá)到10 mmol/L，尿素含量達(dá)3 mol/L，或硫酸銨含量達(dá)3% (約0.227 mol/L)，以及還原劑如硫醇等的存在就會嚴(yán)重干擾測試結(jié)果[5-6,17]。

表1 比較新方法與目前常用的福林酚法試劑配比及組成Table 1 Comparison for reagent components between new and Folin-Ciocalteu’s reagent protein assay

長久以來，有相關(guān)文獻(xiàn)報道對此方法在不同領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行改良[18-20]，有的增加了操作的復(fù)雜性，但效果仍然有限。本研究探討的新方法沒有對原方法繁雜化，且將 SDS耐受性提高了約10倍。實(shí)驗(yàn)中SDS濃度沒有進(jìn)一步增加，是因?yàn)榇郎y樣品溶液的粘度隨著 SDS濃度的上升而不斷增加，幾乎已達(dá)到操作的極限，這應(yīng)該是SDS作為表面活性劑在溶液中的增稠作用所導(dǎo)致的。另外，少量TritonX-100和NP-40也不影響測定結(jié)果，可見新方法對表面活性劑的包容性明顯增加，這可能與B貯存液中添加的少量SDS有關(guān)聯(lián)[21]。

新方法對金屬離子螯合劑 EDTA耐受濃度增加1倍以上，這可能是因?yàn)锽貯存液的Cu2＋濃度顯著降低而減少了工作液中螯合劑能夠結(jié)合的底物，因此提高了對螯合劑的包容性。

同時，新方法對還原劑DTT和β-ME均顯示出一定的耐受性；對含氮化合物如硫酸銨的包容性增加2倍，對尿素的耐受性也有所提高，但相關(guān)機(jī)理不清楚。這可能是新方法顯著增強(qiáng)蛋白質(zhì)樣品在未加入福林酚試劑前的堿性環(huán)境，使 Cu2+與肽骨架的-CO-NH-基團(tuán)形成的藍(lán)色絡(luò)合物反應(yīng)更完全的影響；而且我們實(shí)驗(yàn)使用的蛋白質(zhì)含量檢測范圍明顯高于常用福林酚試劑法的5~100 mg/L[12]，因此新方法對干擾物質(zhì)包容性的增強(qiáng)也可能與檢測靈敏度的變化相聯(lián)系，需要將來進(jìn)一步分析驗(yàn)證。此外，本實(shí)驗(yàn)僅以細(xì)胞裂解液為測定樣品，沒有嘗試其他蛋白樣品的檢測，也沒有針對福林酚試劑法的其他干擾成分如糖類、氨基酸及多肽的影響進(jìn)行探討，因此新方法的適用范圍等還有待深入研究。

綜上所述，新方法操作簡單、迅速，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，檢測范圍0.1~4 g/L，對多種常見干擾成分具有較好的包容性，如表2所示，適用不同裂解液制備的細(xì)胞蛋白檢測，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)具有廣泛應(yīng)用前景。

表2 新方法對常見干擾物質(zhì)的最大耐受濃度Table 2 Highest levels for interferences used in new assay

REFERENCES

[1] Wang M, You J, Mass spectrometry for protein quantification in biomarker discovery. Methods Mol Biol, 2012, 815: 199?225.

[2] Hieb AR, D'Arcy S, Kramer, MA, et al. Fluorescence strategies for high-throughput quantification of protein interactions. Nucleic Acids Res, 2012, 40(5): e33.

[3] Melander C, T?mmeraas K. The influence of sodium hyaluronate molecular weight on protein content according to Lowry and Coomassie blue assays. Carbohydrate Polymers, 2008, 74(3): 745?748.

[4] Goldring JP. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Methods Mol Biol, 2012, 869: 29?35.

[5] Lozzi I, Pucci A, Pantani OL, et al. Interferences of suspended clay fraction in protein quantitation by several determination methods. Anal Biochem, 2008, 376(1): 108?114.

[6] Walker JM. The Bicinchoninic Acid (BCA) assay for protein quantitation//The Protein Protocols Handbook. 3rd ed. Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2009: 11?15.

[7] Kruger NJ. The bradford method for protein quantitation // The Protein Protocols Handbook, 3rd ed. Totowa: Humana Press Inc., 2009: 17?24.

[8] Seevaratnam R, Patel BP, Hamadeh MJ. Comparison of Total Protein Concentration in Skeletal Muscle as Measured by the Bradford and Lowry Assays. J Biochem, 2009, 145(6): 791?797.

[9] Kao SH, Wong HK, Chiang CY, et al. Evaluating the compatibility of three colorimetric protein assays for two-dimensional electrophoresis experiments. Proteomics, 2008, 8(11): 2178?2184.

[10] Carlsson N, Borde A, Wolfel S, et al. Quantification of protein concentration by the Bradford method in the presence of pharmaceutical polymers. Anal Biochem, 2011, 411(1): 116?121.

[11] Banik SP, Pal S, Ghorai S, et al. Interference of sugars in the Coomassie Blue G dye binding assay of proteins. Anal Biochem, 2009, 386(1): 113?115.

[12] Lindeboom N, Wanasundara PKJPD. Interference of phenolic compounds in Brassica napus, Brassica rapa and Sinapis alba seed extracts with the Lowry protein assay. Food Chem, 2007, 104(1): 30?38.

[13] Xu SS, Yan CL, Liu LM, et al. Effects of different cell lysis buffers on protein quantification. J Zhejiang Univ: Med Sci, 2008, 37(1): 45?50.徐珊珊, 閻春蘭, 劉黎明, 等. 細(xì)胞裂解液對蛋白質(zhì)定量方法的影響. 浙江大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版, 2008, 37(1): 45?50.

[14] National Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2010 ed. Beijing: China Medico-Pharmaceutical Science & Technology, 2010.國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典-2010年版. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.

[15] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem, 1951, 193(1): 265?275.

[16] Avella AC, G?rner T, de Donato P. The pitfalls of protein quantification in wastewater treatment studies. Sci Total Environ, 2010, 408(20): 4906?4909.

[17] Noble JE, Bailey MJA. Quantification of protein// Burgess RR, Deutscher MP, eds. Guide to Protein Purification. 2nd ed. San Diego: Elsevier Academic Press, 2009: 73?95.

[18] Peterson GL. Review of the folin phenol protein quantitation method of Lowry, Rosebrough, Farr and Randall. Anal Biochem, 1979, 100(2): 201?220.

[19] Peterson GL. Determination of Total Protein, Methods in Enzymology. London: Academic Press, 1983, 91: 95?119.

[20] Fr?lund B, Griebe T, Nielsen PH. Enzymatic activity in the activated-sludge floc matrix. Appl Microbiol Biotechnol, 1995, 43(4): 755?761.

[21] Field A, Field J. Melamine and cyanuric acid do not interfere with Bradford and Ninhydrin assays for protein determination. Food Chem, 2010, 121(3): 912?917.