趙偉光，劉振武，劉 利，謝延平，林 欣

（1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院骨一科 056001；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院骨科 100050）

后縱韌帶骨化癥（OPLL）是指因后縱韌帶發(fā)生骨化，從而壓迫相應(yīng)節(jié)段的脊髓和（或）神經(jīng)根，產(chǎn)生肢體的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)障礙及內(nèi)臟植物神經(jīng)功能紊亂的一種疾病。由于疾病的遲發(fā)特性，保守治療不能阻止本病的發(fā)展，因此，了解OPLL的病因非常必要。據(jù)統(tǒng)計(jì)，脊柱OPLL 70%發(fā)生于頸椎，胸椎僅占15%，腰椎較少。目前大量研究證實(shí)該病與基因多態(tài)性存在明顯相關(guān)性［1］，筆者已研究了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP-4）基因上4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)6 007C＞T（rs17563）、－5 826G＞A（rs1957860）、3 564C＞ T （rs2855532）和 IVS-160C ＞ T（rs2071047）與頸椎OPLL的關(guān)聯(lián)性，證實(shí)了其中2個(gè)位點(diǎn)與頸椎OPLL的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性［2］。但在腰椎OPLL患者中是否也存在相似關(guān)聯(lián)性，目前國(guó)內(nèi)、外尚無(wú)有關(guān)報(bào)道，本研究首次對(duì)BMP-4基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、與腰椎OPLL關(guān)系進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有入選者皆拍攝腰椎X線平片、CT及采集完整病史，由骨科專家組根據(jù)TsuyamaN的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，將樣本分為腰椎OPLL病例組和對(duì)照組。排除與OPLL有關(guān)的骨代謝疾病。病例組：男21例，女9例；年齡47～65歲，平均56.7歲；對(duì)照組：男19例，女11例；年齡51～70歲，平均60.3歲。收集入選者周圍靜脈血4mL，EDTA-K2抗凝。樣本進(jìn)行隨機(jī)混合編號(hào)。

1.2 主要儀器及試劑 Wizard Genomic DNA Purification Kit購(gòu)自美國(guó)Promega公司，dNTP及

耐熱性DNA酶購(gòu)自日本TaKaRa公司，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司合成。ABI 3730XL DNA測(cè)序儀、PCR儀 MYCYCLER（美國(guó)BIORaD公司）、SIGMA低溫高速離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)Biospectrum。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 利用DNA提取試劑盒進(jìn)行人血白細(xì)胞基因組DNA提取。提取的DNA樣品經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，A260／A280紫外定量，確定每個(gè)樣本已提取DNA成功。

1.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及產(chǎn)物序列測(cè)定 利用PCR儀，50μL反應(yīng)體系對(duì)目的DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增：10×LA PCR緩沖液5μL＋Mg2＋（25mmol／L）5μL＋dNTPs混合液（25mmol／L）8μL＋上游引物（10μmol／L）1μL＋下游引物（10μmol／L）1μL＋Tap酶（5U／μL）0.5μL＋模板2.5μL，最后加滅菌蒸餾水至50μL。反應(yīng)條件及引物見(jiàn)表1，相關(guān)測(cè)序圖見(jiàn)圖1。對(duì)產(chǎn)物純化后用直接測(cè)序法測(cè)定序列。

表1 SNP位點(diǎn)及其引物、擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度

圖1 1位腰椎OPLL患者測(cè)序圖

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。用Chi-square test檢驗(yàn)方法對(duì)病例組與對(duì)照組4個(gè)位點(diǎn)基因型、等位基因型分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

位點(diǎn)6 007C＞T（rs17563）、3564C＞T（rs2855532）基因型、等位基因型在兩組間的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2、3。而其余2個(gè)位點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表2 兩組間位點(diǎn)rs17563、rs2855532基因型的分布比較

表3 兩組間位點(diǎn)rs17563、rs2855532等位基因的分布比較

表4 兩組間位點(diǎn)rs2071047、rs1957860基因型的分布比較

3 討 論

OPLL特征是脊柱椎體對(duì)應(yīng)后縱韌帶發(fā)生異位骨化，骨化的韌帶壓迫相應(yīng)節(jié)段脊髓和（或）神經(jīng)根出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀。OPLL多發(fā)于頸椎，胸、腰椎較少。根據(jù)骨化灶的形態(tài)和范圍可分為4型：連續(xù)型、節(jié)段型、混合型和局灶型。Takashid等［4］從病理學(xué)方面說(shuō)明了骨化的后縱韌帶導(dǎo)致脊髓損傷的主要過(guò)程：骨化組織對(duì)相應(yīng)節(jié)段脊髓首先產(chǎn)生由前向后的直接壓迫，導(dǎo)致脊髓灰質(zhì)、白質(zhì)的壓縮變形，進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞損傷、壞死，側(cè)索和后索出現(xiàn)脫髓鞘改變，從而最終可能出現(xiàn)脊髓壞死或軟化。由于這種疾病的遲發(fā)特性，保守治療不能阻止本病的發(fā)展，因此了解OPLL的病因是非常必要的。目前，有關(guān)頸椎OPLL發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病與遺傳、脊柱退行性改變、長(zhǎng)期反復(fù)應(yīng)力失衡、外傷、先天發(fā)育異常等因素有關(guān)。

已有實(shí)驗(yàn)證明OPLL具有強(qiáng)大的遺傳背景，Taizo等［5］進(jìn)行的一項(xiàng)大樣本病例對(duì)照研究（711名OPLL患者和896名對(duì)照組）發(fā)現(xiàn)TGF-β3基因的單核苷酸多態(tài)性與OPLL的發(fā)生具有顯著相關(guān)性（P＝0.000 40）。Tanno等［6］通過(guò)對(duì)取自10例OPLL患者與10例對(duì)照組后縱韌帶細(xì)胞進(jìn)行的體外單軸循環(huán)拉力誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)OPLL組后縱韌帶細(xì)胞中的ALP、BMP-4、BMP-2、骨橋蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，這說(shuō)明局部應(yīng)力對(duì)該病的發(fā)生也有促進(jìn)作用。趙剛等［7］對(duì)15例腰椎OPLL患者研究，認(rèn)為腰椎OPLL發(fā)病機(jī)制為椎間盤變性后后縱韌帶所受應(yīng)力增大，局部增生、化生而至骨化，所以腰椎OPLL多為局灶型和節(jié)段型。

基因連鎖分析研究表明調(diào)節(jié)骨形成、骨量及其微觀結(jié)構(gòu)的基因定位于染色體14q12-23［8－9］，其中 BMP-4基因位于14q22－23，其除了具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)成骨能力外還通過(guò)BMP-Smads及MAPK的級(jí)聯(lián)激活途徑等廣泛參與包括心血管、胃腸、呼吸、泌尿、生殖及神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎發(fā)育、生長(zhǎng)和分化［10－12］。Sato等［13］進(jìn)行的免疫組織化學(xué)研究表明，BMP-4、BMP-2在后縱韌帶骨化灶表面肥大化生的軟骨細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。筆者已研究了BMP-4基因上4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)6 007C＞T（rs17563），－5 826G＞A（rs1957860），3 564C＞T（rs2855532）和IVS-160C＞T（rs2071047）與頸椎 OPPL的關(guān)聯(lián)性，證實(shí)了其中兩個(gè)位點(diǎn)與頸椎OPLL的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性。但在腰椎OPPL患者中是否也存在相似關(guān)聯(lián)性，目前國(guó)內(nèi)、外尚無(wú)報(bào)道。腰椎OPPL臨床上較少見(jiàn)，本研究通過(guò)多中心才搜集到30例患者，骨化灶全部為局灶型和節(jié)段型，無(wú)1例連續(xù)型且多合并鄰近椎間盤突出，這說(shuō)明局部椎間盤突出可能也參與了腰椎OPLL的發(fā)病過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)6 007C＞T（rs17563）、3 564C＞T（rs2855532）、IVS-160C ＞ T （rs2071047）、－ 5 826G ＞ A（rs1957860）分別位于BMP-4基因外顯子、內(nèi)含子及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5′端，其中rs17563是惟一位于編碼區(qū)域的SNP位點(diǎn)，已有報(bào)道其等位基因C突變?yōu)門從而使產(chǎn)物蛋白質(zhì)分子152位置上的丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，這種突變可以降低絕經(jīng)后婦女粗隆間和全髖關(guān)節(jié)的骨密度少，基因型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［14］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了此位點(diǎn)T基因的突變可誘導(dǎo)腰椎OPLL發(fā)病，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是否與骨化嚴(yán)重程度有關(guān)本文未進(jìn)行研究，因?yàn)楸狙芯克鸭墓腔愋洼^局限易造成偏差。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了BMP-4上rs17563、rs2855532基因突變不僅促使頸椎OPPL的發(fā)生而且與腰椎OPLL也有關(guān)。但是本研究也有一下幾點(diǎn)局限性：病例數(shù)較少；骨化類型較單一，未涉及所有骨化類型。2個(gè)位點(diǎn)基因突變是否也可加重骨化程度尚待研究。

最近，一些血清及其他體液中OPPL標(biāo)志物的研究也可以對(duì)OPLL起到早期診斷作用。Ito等［15］通過(guò)對(duì)脊髓型頸椎病組（n＝35）、OPLL組（n＝7）及對(duì)照組（n＝12）腦脊液中IL-8、IL-10、TNF-α含量的比較得出IL-8在前兩組中的含量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。Sugimori等［16］對(duì)比了43名 OPLL患者中骨化椎體僅限于頸椎和骨化椎體包括頸、胸、腰椎血清中完整骨鈣素、骨鈣素、Ⅰ型前膠原羧基前肽（procollagen I C-terminal propeptide，PICP）及骨特異性堿性磷酸酶的含量水平，結(jié)果顯示前3種蛋白含量頸椎OPLL患者中低于對(duì)照組，而骨特異性堿性磷酸酶則未顯示出明顯差異。Ishihara等［17］則報(bào)道血清中骨鈣素、PICP、ICTP及尿中丙酮酸含量在OPLL組及對(duì)照組中含量未見(jiàn)明顯差異。

腰椎OPPL發(fā)病率較低，但并非臨床上罕見(jiàn)病，由于腰椎肌肉和內(nèi)部臟器影響普通X線較難發(fā)現(xiàn)骨化灶，所以臨床上推薦對(duì)診斷有困難的患者可行三維CT檢查，可準(zhǔn)確測(cè)量韌帶骨化的厚度及范圍，同時(shí)也是制定手術(shù)方案的重要參考。

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