甘 露，黃明元，蒙子君，張 哲，羅炳德△

（1.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院預防醫(yī)學實驗教學中心，廣州 510515；

2.廣東醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣東東莞 523808）

14-3-3σ是14-3-3蛋白家族的一個成員，它可與多種蛋白結合，參與細胞信號轉導、增殖和死亡調控及細胞的遷移運動等，在體內發(fā)揮重要的生物學功能，在腫瘤的發(fā)生、生長、演化過程中發(fā)揮重要作用。研究者發(fā)現(xiàn)14-3-3σ在正常皮膚的基底細胞高表達，在多種上皮來源的腫瘤中發(fā)揮了作用［1－2］。14-3-3σ基因受到包括P53在內的多種轉錄因子的直接調控，14-3-3σ蛋白反過來又能與P53等轉錄因子相螯合，影響轉錄因子發(fā)揮作用［3］。但直至目前，14-3-3σ是否與另一個轉錄因子激活蛋白（activator protein-2α，AP-2α）發(fā)生相互作用尚未見報道。因此，本研究對轉錄因子 AP-2α調控14-3-3σ的作用進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達載體pCMV-Myc購自Clontech公司，pGL3-Basic質粒購自Promega公司，pMD18-T載體、限制性內切酶、T4DNA連接酶、T4聚合酶購自NEB公司，Lipofectamine 2000轉染試劑盒、Trizol試劑購自Invitrogen公司，化學合成的AP-2αsiRNA和siRNA control購自上海吉瑪公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染 人宮頸上皮細胞癌細胞系HeLa細胞由本實驗室保存，在含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，相對濕度95%。細胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA進行消化傳代。細胞轉染利用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000試劑盒，按照試劑盒提供的實驗方法進行轉染。轉染所用的質粒均由本實驗室提供。

1.3 載體構建 為獲得AP-2α過表達質粒，AP-2α全長編碼序列由PCR擴增得到，T載體克隆后酶切連入pCMV-Myc真核表達載體構建成 pCMV-Myc／AP-2α，在細胞轉染后表達Myc／AP-2α。進行雙熒光素酶報告基因分析試驗，以人血液基因組DNA為模板，通過PCR擴增得到人14-3-3σ基因啟動子區(qū)域－1 050～＋299總長度為1 349bp的片斷，將該片斷經(jīng)XhoⅠ／HindⅢ酶切位點插入pGL3-Basic質粒，獲得pGL3／14-3-3σ質粒，PCR 引 物 為：5′-CCG CTC GAG TCT GTG AGC CCC GCT GGT AC-3′（sense）和5′-CCC AAG CTT GTA CTC ACG CAC CTC GGG CC-3′（antisense）。

1.4 熒光定量RT-PCR HeLa細胞接種在6孔板，轉染細胞后48h收集細胞，用Trizol提取總RNA，按Promega的反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行熒光定量PCR。反應條件為95℃5min；95℃預變性15s，60℃退火15s，72℃延伸32s；40個循環(huán)（最后72℃延伸32s收集熒光信號）。PCR引物為如下：CAC TGT CCT CCC TTA AAA GCA（AP-2αsense），ATC TGG GCA ACA AAG GAC TA（AP-2αantisense）；GAA CTT TTC CGT CTT CCA CTA C（14-3-3σsense），TCC ACA GTG TCA GGT TGT CT（14-3-3σantisense）；CCT GGA TAC CGC AGC TAG GA（內參照18srRNA sense），GCGGCGCAATACGAATGCCCC（內參照18srRNA antisense）。

1.5 Western blot HeLa細胞接種在6孔板，轉染細胞后48h收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液（pH7.5的25mmol／L Tris-HCl，137mmol／L NaCl，2.7mmol／L KCl和1%Trixon X-100）充分裂解，離心收集上清液。聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離，轉移蛋白質到聚偏氟乙烯（polyvinylidene flroride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，用 AP-2α和14-3-3σ鼠單克隆抗體（Santa Cruz公司）室溫孵育1h，膜洗3次，辣根過氧化物酶標記的二抗（武漢博士德）室溫孵育1h，膜洗3次，增強化學發(fā)光法（普利萊基因技術有限公司）顯影。

1.6 軟件分析14-3-3σ的啟動子 應用UCSC基因組瀏覽器查找人14-3-3σ基因的啟動子序列并進行轉錄因子 AP-2α的結合位點分析。

1.7 雙熒光素酶報告基因分析試驗 用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System （E1910）進行樣品熒光素酶活性檢測，方法：轉染前1d，細胞以1×104／cm2的密度接種于24孔板上，細胞轉染48h后加入PBS清洗細胞，再加入100μL被動裂解緩沖液，室溫輕微振搖15min，收集細胞裂解液。轉染48h后加入PBS清洗細胞，再加入100μL PLB，室溫輕微振搖15min，收集細胞裂解液。使用手動的雙熒光檢測儀（Promega，GloMax生物發(fā)光檢測儀）讀值。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行多組均數(shù)間比較，結果數(shù)據(jù)以±s表示，方差齊性檢驗后進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 AP-2α對14-3-3σmRNA 水平的影響 在 HeLa細胞內轉染pCMV-Myc／AP-2α過表達質粒后，與轉染空質粒pCMVMyc相比較，AP-2α的 mRNA 水平顯著增高，同時14-3-3σ的mRNA水平也上升。當轉染AP-2αsiRNA干擾AP-2α后，與轉染對照siRNA相比，AP-2α的mRNA水平明顯降低，同時14-3-3σ的mRNA水平也降低，1組和2組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。同時轉染pCMV-Myc／AP-2α過表達質粒和 AP-2αsiRNA，與單獨轉染pCMV-Myc／AP-2α過表達質粒相比，結果顯示AP-2αsiRNA能明顯干擾AP-2α的過表達，同時14-3-3σ的mRNA水平也降低，3組和6組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05），見圖1。

2.2 AP-2α對14-3-3σ蛋白水平的影響 在 HeLa細胞內轉染pCMV-Myc／AP-2α過表達質粒后，與轉染空質粒pCMVMyc相比較，AP-2α的蛋白水平顯著增高，同時14-3-3σ的蛋白水平也上升。當轉染AP-2αsiRNA干擾AP-2α后，與轉染對照siRNA相比，AP-2α的蛋白水平明顯降低，同時14-3-3σ的蛋白水平也降低。同時轉染pCMV-Myc／AP-2α過表達質粒和 AP-2αsiRNA，與單獨轉染pCMV-Myc／AP-2α過表達質粒相比，結果顯示AP-2αsiRNA能明顯干擾AP-2α的過表達，同時14-3-3σ的蛋白水平也降低，見圖2。

圖1 熒光定量RT-PCR結果

圖2 Western blot結果

2.3 人14-3-3σ基因啟動子軟件分析結果 應用UCSC基因組瀏覽器查找人14-3-3σ基因的啟動子序列并進行轉錄因子AP-2α的結合位點分析，顯示了人14-3-3σ基因啟動子區(qū)域轉錄起始位點上游－1 050bp至轉錄起始位點下游299bp共1 349bp長度的基因序列。在這1 349bp的啟動子區(qū)域預測到有10個AP-2α結合位點，見圖3。

2.4 AP-2α對人14-3-3σ基因轉錄活性的影響 HeLa細胞被轉染以pGL3-Basic質粒時，檢測到的熒光素酶活性極低，pGL3-Basic質粒與pCMV-Myc／AP-2α質粒共轉染時，熒光素酶活性仍然很低，說明AP-2α蛋白的過表達對pGL3-Basic質粒的轉錄活性沒有明顯影響。細胞被轉染以pGL3／14-3-3σ質粒后，與對照組pGL3-Basic組相比較，熒光素酶活性顯著增高（3組和1組），說明14-3-3σ啟動子在HeLa細胞中有很強的轉錄活性。pGL3／14-3-3σ質粒和 pCMV-Myc／AP-2α質粒共轉染時，與單獨轉染pGL3／14-3-3σ質粒相比較，熒光素酶活性顯著增強，說明 AP-2α蛋白可以增強14-3-3σ啟動子的轉錄活性，見圖4。

圖3 UCSC基因組瀏覽器在線分析人14-3-3σ基因啟動子結果

圖4 雙熒光素酶報告基因分析試驗結果

3 討 論

哺乳動物的14-3-3蛋白家族至少有7種異構體，即β、γ、ε、ζ、η、σ和τ，它們能與磷酸化蛋白相結合，從而調節(jié)細胞活性，在應激反應后發(fā)生的細胞DNA損傷——有絲分裂前期的周期阻滯中發(fā)揮著重要作用［4］。14-3-3家族的成員σ在正常皮膚的基底細胞高表達，是上皮類細胞的標志分子［5］；并且已經(jīng)證實14-3-3σ在多種上皮來源的腫瘤中發(fā)揮了作用，通過與CDC2、cyclinB結合形成復合物影響細胞周期與細胞凋亡［6－8］。

有文獻報道14-3-3σ基因受到包括P53在內的多種轉錄因子的直接調控，14-3-3σ蛋白反過來又能與P53等轉錄因子相螯合，通過以下3種可能途徑影響轉錄因子發(fā)揮作用：（1）14-3-3σ蛋白與轉錄因子相螯合影響了轉錄因子與下游基因的DNA結合；（2）14-3-3σ蛋白與轉錄因子相螯合影響了轉錄因子自身的蛋白水解；（3）14-3-3σ蛋白與轉錄因子相螯合影響了轉錄因子與其他蛋白的相互作用［7，9－10］。但直至目前，14-3-3σ是否與另一個轉錄因子AP-2發(fā)生相互作用尚未見報道。

AP-2是一個重要的轉錄因子家族，它參與脊椎動物生長發(fā)育、細胞周期與細胞凋亡調節(jié)，病理狀態(tài)下參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。哺乳動物 AP-2家族存在5個亞型：AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ和 AP-2ε，其中，AP-2α與上皮組織關系密切，在成年小鼠中，AP-2α的表達主要集中在皮膚、前列腺、胸腺、眼睛和骨骼肌，AP-2β的表達主要集中在腎臟，AP-2γ主要在胎盤表達。在正常人上皮組織中，AP-2α在基底細胞層表達，AP-2γ在基底細胞、棘細胞和顆粒細胞層表達，而在上皮內未檢測到 AP-2β的表達［11］。最近 研究 發(fā) 現(xiàn) AP-2與乳腺癌［12，13］、卵巢癌［14］、肺癌［15］、睪丸癌［16］、黑色素瘤［17］等上皮來源的腫瘤相關，并通過調控細胞周期與凋亡途徑參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。以前的研究也證實，AP-2α能促使宮頸鱗狀上皮癌細胞系He-La細胞凋亡［18］。

由于AP-2α與14-3-3σ均在正常上皮組織高表達，它們在上皮來源的腫瘤中發(fā)揮了重要作用，因此，AP-2α與14-3-3σ可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中存在密切聯(lián)系。本研究對AP-2α在宮頸癌細胞系 HeLa細胞中調控14-3-3σ的作用進行了初步探討，發(fā)現(xiàn) AP-2α在 HeLa細胞內正調控14-3-3σ的 mRNA水平和蛋白水平。由于AP-2α是轉錄因子，通常是通過其蛋白的DNA結合域與下游基因啟動子區(qū)域的AP-2結合位點相結合來直接調控下游基因的轉錄，因此，用軟件分析了人14-3-3σ基因的啟動子，結果發(fā)現(xiàn)在人14-3-3σ基因啟動子區(qū)域轉錄起始位點上游－1 050bp至轉錄起始位點下游299bp之間，存在10個潛在的AP-2結合位點，雙熒光素酶報告基因分析試驗結果證實了AP-2α可以增強14-3-3σ啟動子的轉錄活性。

本研究結果首次證實了AP-2α正調控HeLa細胞內14-3-3σ的表達，并揭示了這種調控作用可能是通過AP-2α增強14-3-3σ啟動子的轉錄活性來完成的。為深入探討AP-2α調控14-3-3σ的作用奠定了基礎，為闡明 AP-2α和14-3-3σ在上皮腫瘤中的作用提供了新思路。

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