談曉東 蘇 偉 高 楓 周春剛 陸 曙
(南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院 無錫市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 無錫 214001)
動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程,其發(fā)展始終伴隨炎癥反應(yīng)。AS的形成是動(dòng)脈對(duì)內(nèi)膜損傷做出的炎癥-纖維增生性反應(yīng)的結(jié)果。有研究認(rèn)為循環(huán)血液中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)水平可作為反映AS嚴(yán)重程度的良好指標(biāo)[1]。筆者就AS痰濁證素與MMP-9及TIMP-1的關(guān)系進(jìn)行了研究,現(xiàn)報(bào)告如下。
1.1 臨床資料 選取2009年6月至2010年2月南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院(無錫市中醫(yī)醫(yī)院)心血管科AS住院患者78例,男性32例,女性46例;年齡(69.91±10.94)歲,痰濁證素30例,非痰濁證素48例。另從本院體檢中心匹配年齡與性別,選取60例健康人作為健康對(duì)照組。中醫(yī)證素的辨證結(jié)合2002年衛(wèi)生部《中藥新藥治療高血壓病的臨床研究指導(dǎo)原則》[2]和《中藥新藥治療胸痹(冠心病心絞痛)臨床研究指導(dǎo)原則》[2]、《中醫(yī)診斷學(xué)》[3]相關(guān)內(nèi)容,確定 AS 患者的中醫(yī)“證素”診斷標(biāo)準(zhǔn)。由同一位具有多年臨床經(jīng)驗(yàn)的主任中醫(yī)師對(duì)該部分患者運(yùn)用中醫(yī)望、聞、問、切四診,進(jìn)行中醫(yī)證素評(píng)估,準(zhǔn)確、全面收集證素。
1.2 MMP-9及TIMP-1基因表達(dá)的測(cè)定方法 (1)全血總RNA抽提。取入組者晨空腹血2 mL,經(jīng)EDTA-2Na抗凝,0.3 mL全血采用3S柱離心式血液總RNA抽提試劑盒(K3620上海博彩生物科技有限公司)抽提RNA,RNA提取物-80℃保存。(2)MMP-9及TIMP-1 mRNA表達(dá)水平測(cè)定。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。全血總RNA合成cDNA使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(DRR037S大連寶生物工程有限公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL,包括2×SYBRRPremix Ex Taq TM,1~100 ng cDNA,50 pmol/μL引物。兩步法PCR循環(huán)條件:預(yù)變性95℃ 30 s 1個(gè)循環(huán),變性95℃ 5 s,退火/延伸 60℃ 20 s共 40個(gè)循環(huán)。 溶解曲線分析95℃ 1 s,65℃ 15 s,95℃ 1 s。
1.3 相對(duì)定量分析 相對(duì)定量分析采用Light Cycler Relative Quantification(Version1.5)軟件,標(biāo)準(zhǔn)化比值計(jì)算公式采用2-△△CT法,△CT (患者樣本)=CT目的基因-CT內(nèi)參基因,△CT(校正品)=CT目的基因-CT內(nèi)參基因,△△CT=△CT(患者樣本)-△CT(校正品)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以)標(biāo)準(zhǔn)差表示;經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)主要觀察指標(biāo)均符合正態(tài)分布。計(jì)量指標(biāo)兩組間、組內(nèi)比較采用student-t雙尾檢驗(yàn);多組計(jì)量指標(biāo)均數(shù)間比較,方差齊時(shí)采用單因素方差分析,方差不齊時(shí),采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)K-S秩和檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 MMP-9及TIMP-1基因片段電泳結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示:對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的內(nèi)參基因GAPDH的片段大小為94 bp左右,TIMP-1基因片段的大小為102 bp左右,MMP-9基因片段的大小為108 bp左右。如圖1。
圖1 MMP-9、TIMP-1及GAPDH基因片段電泳圖
2.2 MMP-9、TIMP-1和GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線 (Tm) 分析溶解曲線顯示MMP-9、TIMP-1和GAPDH的PCR產(chǎn)物均具有一明顯而尖峭的峰,其溶解溫度 MMP-9為 86.40℃,TIMP-1為 87.10℃,GAPDH為87.80℃。峰溶解溫度為77℃的曲線為未加模板的陰性對(duì)照樣本,具有一個(gè)弱而寬的峰,說明此峰為引物二聚體。峰圖說明MMP-9、TIMP-1和GAPDH特異性PCR產(chǎn)物形成固定溶解溫度的曲線峰,當(dāng)反應(yīng)中含有諸如引物二聚體之類的非特異性副產(chǎn)物時(shí),溶解曲線可能出現(xiàn)兩個(gè)峰。見圖2。
2.3 MMP-9及TIMP-1基因片段的測(cè)序結(jié)果 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆,送南京金斯瑞生物科技公司測(cè)序,經(jīng)比對(duì),該兩種基因與GENBANK上人MMP-9 mRNA(GenBank:NM_004994.2)與 TIMP-1 mRNA(Gen Bank:NM_003254.2)基因片段完全一致。結(jié)果見圖3、4。
圖2 MMP-9、TIMP-1和GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線(Tm)圖
圖3 MMP-9基因片段序列圖
圖4 TIMP-1基因片段序列圖
2.4 痰濁證素與非痰濁證素組MMP-9、TIMP-1基因表達(dá)水平指標(biāo)比較 痰濁證素組MMP-9基因表達(dá)水平大于非痰濁證素組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.418,P<0.05);痰濁證素組TIMP-1基因表達(dá)水平大于非痰濁證素組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.180,P<0.05)。 見表 1。
表1 兩組MMP-9、TIMP-1基因表達(dá)水平比較
表1 兩組MMP-9、TIMP-1基因表達(dá)水平比較
與痰濁證素組比較,△P<0.05。
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運(yùn)用證素進(jìn)行組合辨證,都有助于摒棄紛繁復(fù)雜的表象的干擾,直接把握疾病本質(zhì),提高中醫(yī)辨證論治的可操作性、準(zhǔn)確性,對(duì)臨床診治具有很大指導(dǎo)意義。目前發(fā)現(xiàn),AS的發(fā)生、發(fā)展與MMP-9及TIMP-1基因表達(dá)水平有著重要的關(guān)系[4]。因此,監(jiān)測(cè)血清MMP-9、TIMP-1的基因表達(dá)水平可用于預(yù)測(cè)AS發(fā)生、發(fā)展,有利于及早采取臨床干預(yù)降低死亡率及改善預(yù)后。
目前認(rèn)為,患者先天稟賦不足,陽無以化氣,陰無以成形,導(dǎo)致膏脂過多,滲入血中,發(fā)生高脂血癥而致AS。AS患者多為老年患者,腎虛不能化氣行水,水泛而為痰;肺氣不足,肺失宣降,津液不得通調(diào)輸布,津液留聚而生痰。無錫地處長(zhǎng)江以南,依山傍水,氣候宜人,居民喜食甜膩之品,易礙脾傷胃,故AS的證素分布多以痰濁偏多。
現(xiàn)代研究認(rèn)為,“痰濁”與高脂血癥和高凝狀態(tài)相關(guān)[5],而脂質(zhì)代謝紊亂是AS形成的重要因素,AS患者中合并脂質(zhì)代謝異常的比例較高。一般認(rèn)為,痰濁是高脂血癥的基本病機(jī),而血漿化學(xué)成分改變可引起血漿黏度增高,并能直接影響AS的發(fā)生。血脂代謝紊亂等病理因素導(dǎo)致的血管硬化、管腔狹窄,加上血液的流變性異常,血流緩慢,造成組織器官供血不足而缺血缺氧,代謝產(chǎn)物堆積,有可能是痰濁作為中醫(yī)病理產(chǎn)物在腦動(dòng)脈硬化過程中發(fā)生作用的病理機(jī)制之一[6]。脂代謝異常等可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能與結(jié)構(gòu)損傷,血管壁發(fā)生慢性炎癥,受到致病原侵襲的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子,吸引大量炎癥細(xì)胞移行進(jìn)入內(nèi)皮層下,單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞,后吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞,啟動(dòng)了AS過程。泡沫細(xì)胞不斷分泌釋放包括MMPs在內(nèi)的各種細(xì)胞因子,促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。
本研究顯示,AS痰濁證素組的MMP-9基因表達(dá)水平明顯大于非痰濁證素組,提示AS不同證素有著共同的病理變化,加強(qiáng)對(duì)MMP-9的臨床研究在心血管疾病的防治中有其特殊意義,可將MMP-9基因水平檢測(cè)作為AS病情發(fā)展的一種監(jiān)測(cè)指標(biāo)和AS中醫(yī)辨證分型的客觀指標(biāo)。而痰濁證素組的TIMP-1基因表達(dá)水平明顯大于非痰濁證素組,這個(gè)結(jié)論同樣也可以支持這一觀點(diǎn)。TIMP-1基因表達(dá)水平可反映AS的嚴(yán)重程度,其值隨證素的演變而變化。因此,TIMP-1基因表達(dá)水平可作為中醫(yī)痰濁證素的客觀指標(biāo)。
[1] Pradhan AD,Ridker PM.Do atherosclerosis and type 2 diabetes shares a common inflammatory basis[J].Eur Heart J,2002,23(6):831.
[2] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(第1 輯)[S].1993.
[3] 陳文彬.中醫(yī)診斷學(xué)[M].5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:341-342.
[4] Faia KL,Davis WP,Marone AJ,et al. Matrixmetalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in hamster aortic atherosclerosis:correlation with insituzymography[J]. Atherosclerosis,2002,160(2):325-330.
[5] 程小曲.痰濁型冠心病與血脂、脂蛋白、載脂蛋白的關(guān)系及痰濁形成機(jī)理的探討[J].新中醫(yī),1994,26(3):7-9.
[6] 陳文強(qiáng),李宗信,黃小波,等.影響腦動(dòng)脈硬化患者痰證的多因素分析[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2006,26(12):1618-1619.