劉福利, 王飛久, 孫修濤, 汪文俊, 梁洲瑞

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東青島 266071)

分子育種及其在海帶育種中的研究進(jìn)展

Molecular breeding and its research advances and prospects inLaminaria japonicabreeding

劉福利, 王飛久, 孫修濤, 汪文俊, 梁洲瑞

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東青島 266071)

海帶是一種重要的大型經(jīng)濟(jì)海藻, 具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。我國(guó)海帶大規(guī)模人工養(yǎng)殖始于 20世紀(jì) 50年代, 經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展, 現(xiàn)已形成了較為成熟的養(yǎng)殖技術(shù)體系和較為完善的產(chǎn)業(yè)鏈。目前, 我國(guó)海帶養(yǎng)殖面積約 37 625 ha, 養(yǎng)殖產(chǎn)量約827 965t, 占海藻總產(chǎn)量的60%左右, 產(chǎn)量、規(guī)模位居世界第一[1]。品種決定著養(yǎng)殖海帶的產(chǎn)量和質(zhì)量,是海帶養(yǎng)殖及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)和前提, 良種培育是海帶科技工作者的核心任務(wù),貫穿養(yǎng)殖、加工和銷售整個(gè)海帶產(chǎn)業(yè)鏈。應(yīng)用傳統(tǒng)的育種方法如基于群體水平的選擇育種、雜交育種等, 培育出了一系列的優(yōu)良品系或品種, 推動(dòng)了我國(guó)海帶養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。然而, 傳統(tǒng)海帶育種也存在一些不足。首先, 由于海帶經(jīng)濟(jì)性狀大多為微效多基因控制的數(shù)量性狀, 易受環(huán)境影響[2-5], 導(dǎo)致傳統(tǒng)的表型選擇效率較低; 其次, 由于海帶群體的雜合度較高[2], 為得到穩(wěn)定遺傳的純合系需要多代自交, 導(dǎo)致育種周期延長(zhǎng)[6]。隨著海帶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展, 對(duì)良種的需要更為迫切和多元化, 不僅要求產(chǎn)量高、質(zhì)量?jī)?yōu), 還要抗逆性高(耐高溫)、易于加工(葉片寬大、平直)、收獲期靈活可控(早熟和晚熟品種相搭配)等, 使得傳統(tǒng)育種方法已漸漸不能滿足海帶產(chǎn)業(yè)的良種需求。近20年來(lái), 隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)等新興學(xué)科的飛速發(fā)展, 使育種理論和技術(shù)發(fā)生了重大變革, 分子育種應(yīng)運(yùn)而生。分子育種即在經(jīng)典遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等理論指導(dǎo)下, 將現(xiàn)代生物技術(shù)手段整合于傳統(tǒng)育種方法中, 將表現(xiàn)型和基因型選擇有機(jī)結(jié)合, 從而實(shí)現(xiàn)基因的選擇、轉(zhuǎn)移和聚合, 大幅度提高育種效率, 縮短育種周期, 在提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗性等方面已顯示出巨大潛力, 是一種嶄新的遺傳改良的理論和方法體系, 已成為現(xiàn)代育種的主流方向。

本文將簡(jiǎn)單介紹分子育種的概念、內(nèi)涵及主要內(nèi)容, 綜述當(dāng)前海帶分子育種領(lǐng)域的研究進(jìn)展、存在的問(wèn)題, 指出海帶下一步的研究重點(diǎn)和方向, 最后展望分子育種在海帶遺傳育種中的應(yīng)用前景。

1 分子育種概述

分子育種(Molecular breeding)是分子生物學(xué)與傳統(tǒng)育種學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的嶄新育種理論和方法體系。它在經(jīng)典遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等理論指導(dǎo)下, 將現(xiàn)代生物技術(shù)手段整合于傳統(tǒng)育種方法中, 在人為設(shè)計(jì)和操控下, 或通過(guò)標(biāo)記輔助選育, 或通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段, 實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移和聚合, 得到優(yōu)良基因型組合, 從而培育出優(yōu)良新品種[7]。一般認(rèn)為, 分子育種包括分子標(biāo)記輔助選擇育種、轉(zhuǎn)基因育種和分子設(shè)計(jì)育種三個(gè)方面, 其中分子標(biāo)記輔助選擇和轉(zhuǎn)基因育種是分子育種的兩大基本模塊, 分子設(shè)計(jì)育種將分子標(biāo)記輔助選擇和轉(zhuǎn)基因育種有機(jī)結(jié)合, 是分子育種的高級(jí)階段, 三者共同構(gòu)成了分子育種的完整體系。

1.1 分子標(biāo)記輔助選擇

借助分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀基因型直接選擇的方法稱為分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular Assisted Selection, MAS), 包括對(duì)目標(biāo)基因的選擇即前景選擇(Foreground selection)或稱正向選擇和對(duì)遺傳背景的選擇(Background selection)也稱負(fù)向選擇[8]。分子標(biāo)記輔助選擇是一種新的遺傳改良方法, 主要是利用分子標(biāo)記與需要改良的目的基因緊密連鎖或共分離的關(guān)系, 用標(biāo)記對(duì)育種材料進(jìn)行目標(biāo)基因組區(qū)域選擇, 同時(shí)對(duì)全基因組進(jìn)行篩選, 大大提高選擇的精度, 從而提高選擇育種效率。目前, 分子標(biāo)記輔助選擇育種主要應(yīng)用于質(zhì)量性狀, 涉及的基因多為單基因或少數(shù)幾個(gè)基因[9]。對(duì)于數(shù)量性狀來(lái)說(shuō), 由于QTL表達(dá)常與環(huán)境和遺傳背景密切相關(guān), 當(dāng)前檢測(cè)到的QTL穩(wěn)定性差、精度不高, 降低了分子標(biāo)記輔助選擇育種的效率[10-11]。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題一些新的對(duì)策被提出, 例如, 利用近等基因系進(jìn)行育種[10], 或利用高代回交系同時(shí)進(jìn)行QTL分析和遺傳改良[12], 或用全基因組選擇技術(shù)(Genomic selection)來(lái)解決多基因控制的低遺傳力性狀的改良問(wèn)題[13]。

1.2 轉(zhuǎn)基因育種

轉(zhuǎn)基因育種是根據(jù)育種目標(biāo), 將從供體生物中分離出的目的基因?qū)胧荏w作物中, 經(jīng)過(guò)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的重組子, 并經(jīng)過(guò)田間實(shí)驗(yàn)與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種。轉(zhuǎn)基因育種的優(yōu)點(diǎn)是可打破生殖隔離, 實(shí)現(xiàn)不同種間的遺傳物質(zhì)交流, 可對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行定向變異和選擇, 從而提高選擇效率、加快育種進(jìn)程。目前, 多種農(nóng)作物或經(jīng)濟(jì)作物中已建立起成熟的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系, 如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、基因槍法、超聲波介導(dǎo)法等等, 為外源基因的導(dǎo)入奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。自1983年獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物至今, 主要農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因研究取得了較大進(jìn)展,將一些與重要性狀如抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑、抗逆、品質(zhì)改良、發(fā)育調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)吸收等外源基因轉(zhuǎn)入了主要農(nóng)作物。全球已有35科120種植物轉(zhuǎn)基因成功,目前已有30個(gè)國(guó)家先后批準(zhǔn)了3 000多例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn), 所涉及的植物有 40多種, 主要是玉米、油菜、馬鈴薯、番茄、大豆和棉花, 其中有50多個(gè)農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因的品種投入商業(yè)化生產(chǎn)[14]。盡管轉(zhuǎn)基因技術(shù)在應(yīng)用上存在安全性問(wèn)題, 但值得肯定的是, 它是一項(xiàng)非常有用的生物技術(shù), 在作物育種方面有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

1.3 分子設(shè)計(jì)育種

分子設(shè)計(jì)育種的概念最早是由荷蘭科學(xué)家Peleman和van der Voort提出的[15]。它通過(guò)多種技術(shù)的集成與整合, 在育種家的田間試驗(yàn)之前, 對(duì)育種程序中的各種因素進(jìn)行模擬、篩選和優(yōu)化, 確立目標(biāo)基因型及獲得目標(biāo)基因的手段和途徑(如最佳的親本選配, 后代選擇策略, 或轉(zhuǎn)基因體系), 提高育種過(guò)程中的預(yù)見(jiàn)性, 從而實(shí)現(xiàn)高效率育種。分子設(shè)計(jì)育種的核心是基于對(duì)控制作物各種重要經(jīng)濟(jì)性狀的主效基因或 QTL功能及其等位變異的深刻認(rèn)識(shí), 需要找到育種目標(biāo)性狀的基因/QTL或其緊密連鎖標(biāo)記, 充分了解QTL位置、遺傳效應(yīng)、QTL之間的互作、QTL與環(huán)境之間的互作等信息, 需要綜合利用遺傳學(xué)、育種學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、生理學(xué)和生物信息學(xué)等多方面信息和手段[16]。據(jù)此, 要開(kāi)展作物分子設(shè)計(jì)育種必需具有以下基本條件：高密度遺傳圖譜和高效的分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù); 定位重要經(jīng)濟(jì)性狀的調(diào)控基因或 QTL并對(duì)其進(jìn)行遺傳解析; 建立并完善遺傳信息數(shù)據(jù)庫(kù);開(kāi)發(fā)并完善進(jìn)行作物設(shè)計(jì)育種模擬研究的統(tǒng)計(jì)分析方法及相關(guān)軟件; 掌握可用于設(shè)計(jì)育種的種質(zhì)資源與育種中間材料[16]。總之, 作物分子設(shè)計(jì)育種是以基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)等為基礎(chǔ)而發(fā)展起來(lái)的一個(gè)綜合性的新興研究領(lǐng)域, 可大幅度提高育種效率, 縮短育種年限。盡管分子設(shè)計(jì)育種的概念已提出多年, 但其實(shí)質(zhì)性的研究工作才剛剛起步[17],當(dāng)前應(yīng)該大力加強(qiáng)這方面的基礎(chǔ)理論研究和技術(shù)平臺(tái)建設(shè), 為真正實(shí)現(xiàn)分子設(shè)計(jì)育種的目標(biāo)提供理論與技術(shù)支撐。

2 海帶分子育種的研究進(jìn)展

2.1 海帶分子標(biāo)記輔助選育

分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于海帶遺傳育種研究領(lǐng)域的時(shí)間較晚, 目前主要用于海帶群體遺傳學(xué)研究(如群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系分析等)、種質(zhì)鑒定等方面, 也有少量應(yīng)用分子標(biāo)記對(duì)海帶進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)、遺傳圖譜繪制及基因或QTL定位分析的研究報(bào)道。

(1)海帶分子群體遺傳學(xué)研究進(jìn)展。應(yīng)用不同的分子標(biāo)記, 分析評(píng)價(jià)海帶及其近緣種的群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道較多。夏鵬等[18]以海帶優(yōu)良品種“901”為材料在海帶中建立起RAPD技術(shù);He等[19]應(yīng)用RAPD技術(shù)分析了海帶、奧霍海帶和長(zhǎng)海帶共18個(gè)配子體的遺傳多樣性。周志剛等[20]應(yīng)用同功酶和 RAPD技術(shù)對(duì)中國(guó)海區(qū)海帶不同栽培品系及長(zhǎng)海帶的配子體無(wú)性繁殖系進(jìn)行了遺傳多樣性分析。Wang等[21]應(yīng)用ISSR標(biāo)記方法, 對(duì)10對(duì)海帶配子體的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。另外 Shi等[22]、尚書(shū)等[23]、Li等[24]、石媛媛等[25]、張全勝等[26]、Shan等[27]、Bi[28]和汪文俊等[29]應(yīng)用RAPD,ISSR,SSR,AFLP和 ITS標(biāo)記技術(shù)對(duì)海帶及長(zhǎng)海帶進(jìn)行了遺傳多樣性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析。這些工作研究了海帶種質(zhì)材料的遺傳信息, 為海帶遺傳育種打下了基礎(chǔ)。然而, 當(dāng)前海帶群體遺傳學(xué)分析主要是以養(yǎng)殖品種的配子體為研究對(duì)象, 少有海帶的近緣種和野生種的孢子體信息, 下一步的工作應(yīng)該將海帶的近緣種和不同野生類群納入海帶的種質(zhì)資源研究范疇, 整合分子水平上的數(shù)據(jù)和性狀表型數(shù)據(jù), 對(duì)海帶種質(zhì)和育種材料進(jìn)行綜合分析評(píng)價(jià), 為海帶種質(zhì)資源的有效保護(hù)和高效利用奠定基礎(chǔ)。

(2)分子標(biāo)記在海帶種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用。He等[19]應(yīng)用 RAPD技術(shù)評(píng)價(jià)了海帶種質(zhì); Wang等[30]運(yùn)用RAPD分析技術(shù), 對(duì)33個(gè)海帶配子體進(jìn)行了種質(zhì)鑒定, 構(gòu)建了 33個(gè)配子體的指紋圖譜; 張全勝等[26]應(yīng)用 AFLP技術(shù)構(gòu)建了包括海帶、長(zhǎng)海底、利尻海帶和掌狀海帶共 11個(gè)野生品系或品種的種質(zhì)指紋圖譜。海帶不同種質(zhì)材料的指紋圖譜構(gòu)建, 為它們?cè)诤ХN質(zhì)改良和品種培育高效利用奠定了基礎(chǔ)。

(3)應(yīng)用分子標(biāo)記預(yù)測(cè)海帶雜種優(yōu)勢(shì)。雜種優(yōu)勢(shì)(Heterosis)是指兩個(gè)遺傳組成不同的親本雜交產(chǎn)生的雜種在生活力、生長(zhǎng)勢(shì)、適應(yīng)性、抗逆性和繁殖能力等方面優(yōu)于雙親的現(xiàn)象。雜種優(yōu)勢(shì)是生物界普遍存在的一種現(xiàn)象, 已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用。對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)一直是育種學(xué)的難題。傳統(tǒng)方法主要通過(guò)性狀的配合力分析和聚類分析進(jìn)行預(yù)測(cè), 需要配合大量的雜交組合和大量繁瑣的田間性狀調(diào)查。用分子標(biāo)記的方法進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè), 并以此來(lái)選擇理想親本和輔助育種, 是解決上述問(wèn)題的有效途徑[31-32]。在海帶中, Li等[32]利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)對(duì)27個(gè)配子體雜交親本進(jìn)行了遺傳相似性分析, 并對(duì)株長(zhǎng)、株寬、株厚、株鮮質(zhì)量、株干質(zhì)量、產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)率與配子體親本之間的遺傳距離進(jìn)行了回歸分析。建立了配子體克隆親本遺傳相似度與雜種優(yōu)勢(shì)之間的量化關(guān)系, 用以預(yù)測(cè)雜交子代的雜種優(yōu)勢(shì)。利用該預(yù)測(cè)體系對(duì)可能產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)的組合進(jìn)行了預(yù)測(cè)并在生產(chǎn)中驗(yàn)證, 可減少親本配組的盲目性, 實(shí)現(xiàn)海上評(píng)價(jià)組合數(shù)的科學(xué)減量, 從而提高育種效率。

(4)海帶遺傳圖譜構(gòu)建的研究進(jìn)展。遺傳圖譜(genetic map)是指通過(guò)遺傳重組分析得到的基因或遺傳標(biāo)記在染色體上的線性排列順序圖。遺傳圖譜反映了遺傳標(biāo)記與少數(shù)功能基因之間的相對(duì)關(guān)系,它不僅是遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容,又是種質(zhì)資源、育種及基因克隆等許多應(yīng)用研究的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。海帶的遺傳圖譜工作還剛剛起步。Li等[33]采用AFLP分子標(biāo)記對(duì)“長(zhǎng)海帶×真海帶”雜交F1代群體60個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳分析, 根據(jù)“雙向擬測(cè)交”策略分別構(gòu)建了長(zhǎng)海帶和真海帶的遺傳連鎖圖譜。該圖譜是海帶的第一張遺傳連鎖圖譜, 定位了81個(gè)AFLP標(biāo)記,其平均標(biāo)記密度為 8 cM。Yang等[34]應(yīng)用 AFLP和SSR標(biāo)記, 以40個(gè)配子體克隆為作圖群體構(gòu)建了海帶雌、雄配子體的遺傳圖譜, 該遺傳圖譜的標(biāo)記密度為7.91 cM, 基因組覆蓋率為66%。Liu 等[35]利用海帶的兩個(gè)品系雜交后的 F2代為作圖群體(兩親本特征為：一個(gè)葉片寬而薄, 一個(gè)葉片長(zhǎng)而窄), 構(gòu)建了一個(gè)包含 28個(gè)連鎖群的遺傳圖譜, 定位了 142個(gè)AFLP標(biāo)記, 標(biāo)記平均兼具為9.4 cM, 基因組覆蓋率為68.4%。總體來(lái)說(shuō), 雖然目前海帶遺傳作圖還存在作圖群體較小、飽和度和基因組覆蓋率較低等問(wèn)題,但它們?yōu)楹Х肿訕?biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建做了有益的嘗試, 初步得到了海帶遺傳框架圖, 探討了海帶遺傳圖譜構(gòu)建中一些技術(shù)和理論問(wèn)題, 為將來(lái)更高飽和度和基因組覆蓋率圖譜的構(gòu)建打下了基礎(chǔ)。

(5)海帶性狀相關(guān)基因或QTL定位和分析。所謂基因定位即確定基因在染色體上的位置和排列順序的過(guò)程。應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜, 并在圖譜基礎(chǔ)上通過(guò)連鎖分析確定基因的染色體座位,是基因定位的一種常用方法。在海帶中, Yang等[34]應(yīng)用 AFLP和 SSR標(biāo)記, 將海帶的性別看作一個(gè)標(biāo)記, 通過(guò)連鎖分析把可能控制海帶性別的基因定位到海帶遺傳圖譜的 LG2連鎖群上。Liu等[36]鑒定得到一個(gè)與海帶雌性配子體相連鎖的 SCAR標(biāo)記FRML-494, 并證明該標(biāo)記僅存于海帶雌配子體中,可用于海帶的雌、雄配子體鑒定。Liu等[37]應(yīng)用BSA法, 篩選出與海帶葉片長(zhǎng)度連鎖的標(biāo)記 FL-569, 遺傳作圖和連鎖分析證明該標(biāo)記與控制海帶長(zhǎng)度的主效 QTL相連鎖, 驗(yàn)證結(jié)果表明該標(biāo)記對(duì)長(zhǎng)葉片海帶的選擇成功率在 80%以上。Liu 等[38]在構(gòu)建遺傳圖譜的基礎(chǔ)上, 定位到3個(gè)與葉長(zhǎng)相關(guān)的QTL、2個(gè)與葉寬相關(guān)的QTL。

總體來(lái)說(shuō), 海帶分子標(biāo)記輔助選擇育種還處于起步階段, 主要工作集中在育種群體材料的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系分析和種質(zhì)鑒定上,這些工作可對(duì)育種親本材料選擇提供參考信息。然而, 與目標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記卻罕有報(bào)道, 而連鎖標(biāo)記是分子標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)和前提, 這就限制了分子標(biāo)記輔助選擇在海帶育種中的應(yīng)用。

2.2 海帶轉(zhuǎn)基因育種研究進(jìn)展

大型經(jīng)濟(jì)海藻轉(zhuǎn)基因育種研究始于 20世紀(jì) 90年代初, 研究?jī)?nèi)容主要集中在載體組件(含啟動(dòng)子、報(bào)告基因)篩選和載體構(gòu)建、有效轉(zhuǎn)化方法優(yōu)化和建立、轉(zhuǎn)化子的篩選(選擇標(biāo)記)、基因整合及表達(dá)的檢測(cè)、受體與植株再生途徑探索等方面。載體組件(含啟動(dòng)子、報(bào)告基因)篩選和載體構(gòu)建方面, 一系列啟動(dòng)子如CaMV 35S啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、FCP啟動(dòng)子、AMT啟動(dòng)子被證明可用作海帶基因工程載體的啟動(dòng)子元件, 并且發(fā)現(xiàn)FCP啟動(dòng)子與CaMV 35S啟動(dòng)子的效率較高, 通過(guò)轉(zhuǎn)化海帶雌配子體, FCP啟動(dòng)子-GUS基因能在孤雌生殖海帶中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)[39];一些報(bào)告基因如lacZ基因、gus基因、cat基因、bar基因等在海帶中被瞬間或穩(wěn)定表達(dá)[40]。在遺傳轉(zhuǎn)化方面, 海帶的轉(zhuǎn)化方法主要是采用基因槍法, 其基本原理是利用高壓氣體或火藥作驅(qū)動(dòng)力, 將吸附或包裹有DNA的金粉微粒高速發(fā)射, 擊中并穿透受體的細(xì)胞壁及膜系統(tǒng), 達(dá)到導(dǎo)入外源DNA的目的。多年研究結(jié)果表明, 基因槍法對(duì)海帶組織切塊、雌配子體、雄配子體以及孢子體幼苗均有效, 而且未發(fā)現(xiàn)粒子轟擊對(duì)雌配子體孤雌生殖有抑制作用[41-43]; 另外,病毒可作為褐藻基因工程的載體, 為褐藻基因工程提供了新途徑[44]。在轉(zhuǎn)化子篩選方面, 建立起了采用氯霉素-cat基因的選擇系統(tǒng)。受體與植株再生途徑探索方面, 目前大型海藻原生質(zhì)體和愈傷組織再生方法尚不穩(wěn)定, 可借助海帶自身異型世代交替生活史的特點(diǎn), 將單倍的配子體作為轉(zhuǎn)化對(duì)象, 轉(zhuǎn)化后通過(guò)孤雌或受精發(fā)育而生成孢子體, 從而完成整個(gè)轉(zhuǎn)基因操作[45]。

總之, 20世紀(jì)90年代初起, 初步建立了海帶模式轉(zhuǎn)化系統(tǒng), 即以SV40為啟動(dòng)子,cat基因?yàn)檫x擇標(biāo)記, 用基因槍轉(zhuǎn)化, 以雌配子體為轉(zhuǎn)化受體, 孤雌生殖作為植株再生方式, 經(jīng)氯霉素篩選, 獲得轉(zhuǎn)基因海帶。目前已獲得轉(zhuǎn)外源報(bào)告基因植株并獲得國(guó)家發(fā)明專利(秦松等, ZL96120235.1)。展現(xiàn)出構(gòu)建高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗逆的海帶良種的廣泛前景, 也證明了海帶作為廉價(jià)的生物反應(yīng)器, 通過(guò)構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)大量的蛋白、藥物或天然活性物質(zhì)的可行性和巨大潛力。然而, 目前海帶基因工程還處于探索階段, 其遺傳轉(zhuǎn)化模型的有效性和安全性還有待于進(jìn)一步的改進(jìn)或驗(yàn)證, 尚未真正應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因育種中來(lái)。

2.3 海帶分子設(shè)計(jì)育種

隨著基因組測(cè)序等多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)突破, 基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等多門“組學(xué)”及生物信息學(xué)得到迅猛發(fā)展, 極大地促進(jìn)了水稻、玉米、小麥等農(nóng)作物遺傳育種在分子水平上的發(fā)展, 基于此荷蘭科學(xué)家Peleman和van der Voort最早提出分子設(shè)計(jì)育種的概念[15]。由于海帶的總體研究基礎(chǔ)較為薄弱, 目前分子設(shè)計(jì)育種在海帶遺傳育種領(lǐng)域還僅僅停留在引入概念的階段, 實(shí)質(zhì)性的工作還沒(méi)有開(kāi)展。但是, 經(jīng)濟(jì)海藻遺傳育種領(lǐng)域的一些科研工作者, 已意識(shí)到分子設(shè)計(jì)育種將是海帶遺傳育種的重要發(fā)展方向, 一些基礎(chǔ)性工作已有報(bào)道, 如 Liu等[38]利用 F2代為作圖群體構(gòu)建了中高密度的海帶遺傳圖譜(標(biāo)記密度為6.7cM), 定位到3個(gè)與葉長(zhǎng)相關(guān)的QTL, 能解釋海帶葉片長(zhǎng)度變異的 42.36%, 表現(xiàn)為部分顯性效應(yīng)或加性效應(yīng); 定位了2個(gè)與葉寬相關(guān)的QTL, 可以解釋葉寬變異的36.39%, 表現(xiàn)出部分顯性效應(yīng)。另外, 海帶基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作也將展開(kāi)。

3 海帶分子育種研究方向和前景展望

分子育種將是海帶現(xiàn)代遺傳育種的主流方向,鑒于海帶當(dāng)前的總體研究現(xiàn)狀, 為推動(dòng)海帶分子育種的發(fā)展, 必須做好以下五點(diǎn)工作：

3.1 研發(fā)海帶分子育種的各項(xiàng)技術(shù)

在作物分子育種中, 從種質(zhì)資源到新基因發(fā)掘,再到品種培育及其產(chǎn)業(yè)化, 是一個(gè)完整的鏈條。通過(guò)提高育種效率來(lái)高效培育突破性新品種并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的目標(biāo)貫穿始終, 各環(huán)節(jié)間實(shí)現(xiàn)無(wú)縫鏈接, 形成了“基礎(chǔ)研究、標(biāo)記開(kāi)發(fā)、基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化、品種培育、產(chǎn)品推廣”的完整產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)體系[6]。為推動(dòng)海帶分子育種的發(fā)展, 應(yīng)該加快研發(fā)適用于海帶研究的相關(guān)技術(shù)體系, 如規(guī)?；_(kāi)發(fā)成本低廉、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作的分子標(biāo)記, 推動(dòng)海帶分子標(biāo)記由隨機(jī)性、顯性標(biāo)記(如RAPD、ISSR和AFLP標(biāo)記)向特異性、共顯性和功能性標(biāo)記(SSR、SNP標(biāo)記)轉(zhuǎn)變; 提高海帶具有重要價(jià)值的功能基因(高產(chǎn)基因、抗逆基因等)的發(fā)掘能力; 構(gòu)建起穩(wěn)定的載體系統(tǒng)和高效的轉(zhuǎn)化體系, 建立起有效的海帶表達(dá)系統(tǒng); 開(kāi)發(fā)用于設(shè)計(jì)育種模擬研究的統(tǒng)計(jì)模型和相關(guān)軟件;探索和建立高效的良種推廣和產(chǎn)業(yè)化技術(shù)。

3.2 保存和豐富海帶種質(zhì)資源和育種中間材料

種質(zhì)資源(Germplasm resources)積累了由自然和人工引起的遺傳變異, 蘊(yùn)藏著具有重要價(jià)值的基因,是進(jìn)行新品種選育和發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。海帶種質(zhì)資源的重要性已引起重視, 并已建立起合適的種質(zhì)保存技術(shù)且種質(zhì)庫(kù)初具規(guī)模, 但是僅停留在種質(zhì)收集、保存和評(píng)價(jià)的初級(jí)階段, 缺少高效構(gòu)建核心種質(zhì)及其有效評(píng)價(jià)的技術(shù)方法, 下一步應(yīng)構(gòu)建海帶核心種質(zhì), 提高整個(gè)種質(zhì)資源庫(kù)的管理和利用水平, 促進(jìn)對(duì)種質(zhì)資源中蘊(yùn)藏的具有重要價(jià)值基因的發(fā)掘。另外, 目前海帶中雖有一些重組自交系, 但是總體上還缺乏多種作圖群體或育種中間材料, 如近等位基因系、回交群體、高代回交系、導(dǎo)入系、染色體片段代換系等。這些群體是繪制遺傳圖譜和性狀 QTL定位和分析的前提, 也是品種培育重要中間材料, 下一步工作應(yīng)該重視這些群體和育種中間材料的構(gòu)建和保存工作。

3.3 發(fā)掘海帶的性狀連鎖標(biāo)記、QTL和功能基因

我國(guó)已初步建立起了海帶的種質(zhì)資源庫(kù), 但缺乏對(duì)種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、表型和基因型鑒定, 每份種質(zhì)資源中所含的基因和等位基因變異尚不清楚, 不同等位基因的頻率、分布和效應(yīng)更無(wú)從得知, 這已成為開(kāi)發(fā)標(biāo)記、克隆基因和設(shè)計(jì)品種的瓶頸。盡管種質(zhì)資源不能申請(qǐng)專利保護(hù), 但從中獲得的基因、調(diào)控元件和標(biāo)記可以具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)。因此, 世界各國(guó)尤其是發(fā)達(dá)國(guó)家的跨國(guó)公司利用其技術(shù)優(yōu)勢(shì)搶先注冊(cè)知識(shí)產(chǎn)權(quán), 給自身的分子育種保駕護(hù)航。因此, 海帶分子育種也要加強(qiáng)海帶的性狀連鎖標(biāo)記、QTL和功能基因的挖掘, 應(yīng)用大規(guī)模、高通量的基因鑒定技術(shù), 獲得一批重要性狀基因標(biāo)記, 快速克隆一批具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的功能基因, 通過(guò)目的基因的轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化和聚合從而獲得優(yōu)良基因型組合的新品種。

3.4 深度解析海帶重要經(jīng)濟(jì)性狀的形成機(jī)制

海帶很多經(jīng)濟(jì)性狀都是數(shù)量性狀, 由微效多基因控制且易受環(huán)境影響, 有著復(fù)雜的形成機(jī)制和遺傳基礎(chǔ)。為闡明海帶復(fù)雜經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳基礎(chǔ)和生理、生化機(jī)制, 用綜合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和表型組學(xué)等的研究理論和方法, 闡明性狀基因/QTL的座位、數(shù)量和效應(yīng), 性狀基因/QTL之間的和基因/QTL與環(huán)境之間的互作關(guān)系, 建立重要經(jīng)濟(jì)性狀的GP(Genotype to phenotype)模型, 解析性狀形成的發(fā)育過(guò)程、信號(hào)調(diào)控途徑和代謝網(wǎng)絡(luò), 從系統(tǒng)生物學(xué)的角度、在不同層次上(分子、細(xì)胞、組織器官、個(gè)體甚至群體水平)上深度解析海帶重要經(jīng)濟(jì)性狀的形成機(jī)制, 為分子設(shè)計(jì)和人工操作奠定基礎(chǔ)。

3.5 推動(dòng)分子育種與傳統(tǒng)育種相結(jié)合

由于分子生物學(xué)的研究主要是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,而育種研究主要的工作需要在室外完成, 兩方面研究人員由于受研究條件、原有知識(shí)的慣性導(dǎo)向和現(xiàn)有評(píng)價(jià)體系上存在的差別, 容易導(dǎo)致兩方面工作脫節(jié)。因此, 下一步應(yīng)創(chuàng)新分子育種的組織體系和實(shí)施機(jī)制, 一方面倡導(dǎo)分子育種工作走出實(shí)驗(yàn)室, 吸收和借用傳統(tǒng)育種理論和技術(shù), 另一方面引導(dǎo)傳統(tǒng)育種工作者借力分子育種的高效性和先進(jìn)性, 通過(guò)整合資源、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ), 實(shí)現(xiàn)育種鏈上中下游的緊密結(jié)合,實(shí)現(xiàn)分子手段與常規(guī)育種的緊密結(jié)合。

總之, 分子育種是在分子生物學(xué)和各種組學(xué)跨越式發(fā)展的時(shí)代背景下產(chǎn)生的, 是一種嶄新的遺傳育種的理論和技術(shù)體系, 將是海帶遺傳育種的發(fā)展方向。伴隨著海帶分子育種研究和實(shí)踐的深入, 并結(jié)合傳統(tǒng)育種理論和方法, 海帶遺傳育種必將出現(xiàn)跨越式發(fā)展, 從而推動(dòng)海帶養(yǎng)殖及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

[1]劉增勝, 柳正．中國(guó)漁業(yè)年鑒[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2010.

[2]方宗熙, 蔣本禹, 李家俊．海帶柄長(zhǎng)的遺傳[J]．植物學(xué)報(bào), 1962, 10(4)：327-335.

[3]方宗熙, 蔣本禹, 李家?。~片長(zhǎng)度遺傳的進(jìn)一步研究[J]．海洋與湖沼, 1965, 7(1)：59-66.

[4]張景鏞, 方宗熙．海帶葉片厚度遺傳的初步研究[J]．遺傳學(xué)報(bào), 1980, 7(3)：257-262.

[5]王清?。讉€(gè)經(jīng)濟(jì)性狀遺傳力和遺傳相關(guān)的研究[J]．山東海洋學(xué)院學(xué)報(bào), 1984, 14(3)：65-76.

[6]馮蕾, 唐學(xué)璽, 張培玉．海帶育種育苗技術(shù)研究進(jìn)展[J]．科學(xué)技術(shù)與工程, 2005, 5(8)：491-495.

[7]黎裕, 王建康, 邱麗娟, 等．中國(guó)作物分子育種現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J]．作物學(xué)報(bào), 2010, 36(9)：1425-1430.

[8]Hospital F, Charcosset A. Marker-assisted introgression of quantitative trait loci [J]. Genetics, 1997, 147：1469-1485.

[9]Xu Y, Crouch J H. Marker-assisted selection in plant breeding：from publications to practice [J]. Crop Science, 2008, 48：39-407.

[10]Stuber C W, Polacco M, Senior M L. Synergy of empirical breeding, marker-assisted selection, and genomics to increase crop yield potential [J]. Crop Science, 1999, 39：571-1583.

[11]Bernardo R. Molecular marker and selection for complex traits in plants：learning from the last 20 years [J].Crop Science, 2008, 48：1649-1664.

[12]Tanksley S D, Nelson J C. Advanced backcross QTL analysis：a method for the simultaneous discovery and transfer of valuable QTLs from unadapted germplasm into elite breeding lines [J]. Theoretical and Applied Genetics, 1996, 92：191-203.

[13]Heffner E L, Sorrells M E, Jannink J L. Genomic selection for crop improvement [J]. Crop Science, 2009, 49：1-12.

[14]馬忠強(qiáng), 尹航．轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用[J]．現(xiàn)代化農(nóng)業(yè), 2009, 363：25-26．

[15]Peleman J D, van der Voort J R. Breeding by design [J].Trends in Plant Science, 2003, 8：330-334.

[16]顧銘洪, 劉巧泉．作物分子設(shè)計(jì)育種及其發(fā)展前景分析[J]．揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 30(1)：64-67.

[17]黎裕, 王建康, 邱麗娟, 等. 中國(guó)作物分子育種現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J]. 作物學(xué)報(bào), 2010, 36(9)：1425-1430.

[18]夏鵬, 楊迎霞, 劉升平, 等. 海帶“901”配子體DNA隨機(jī)擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化[J]. 海洋科學(xué), 2003, 27(5)：22-26.

[19]He Y J, Zou Y P, Wang X D, et al. Assessing the germplasm ofLaminaria(Phaeophyceae) with random amplified polymorphic DNA(RAPD) method [J]. Chinese Journal of Oceanology Limnology, 2003, 21：141-148.

[20]周志剛, 史西志, 胡遠(yuǎn)皆, 等．中國(guó)海區(qū)不同養(yǎng)殖品系海帶與長(zhǎng)海帶之間的遺傳關(guān)系[J]．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2003, 10(6)：474-480．

[21]Wang X L, Liu C L, Li X J, et al. Assessment of genetic diversities of selectedLaminaria(Laminariales, Phaeophyta) gametophytes by Inter-Simple Sequence Repeat Analysis [J]. J Integr Plant Biol, 2005, 47(6)：753-758.

[22]Shi C J, Hu Z M, He Y J, et al. Identification and assessing the cultivars ofLaminariaLamx. (Phaeophyceae) with molecular markers [J]. J Integr Plant Biol,2005, 47(3)：283-291

[23]尚書(shū), 石媛媛, 楊官品．我國(guó)引種海帶(Laminaria japonica)和長(zhǎng)海帶(L. longissima)配子體克隆隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析[J]．海洋湖沼通報(bào), 2007, 增刊：142-146．

[24]Li B J, Shi Y Y, Yang G P, et al. Microsatellite DNA variation of the gametophyte clones isolated from introducedLaminaria japonica(Phaeophyta) andL.longissimaof China and varieties derived from them [J].Journal of Integrative Plant Biology, 2008a, 50 (3)：352-59.

[25]石媛媛, 楊官品, 廖梅杰, 等．海帶和長(zhǎng)海帶配子體無(wú)性繁殖系微衛(wèi)星DNA多態(tài)性比較分析[J]．中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 38(1)：303-308．

[26]張全勝, 石媛媛, 叢義周, 等．我國(guó)引種海帶和栽培品種(系)來(lái)源配子體克隆的AFLP分析[J]．中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 38(3)：429-435．

[27]Shan T F, Pang S J, Zhang Y R, et al. An AFLP-based survey of genetic diversity and relationships of major farmed cultivars and geographically isolated wild populations ofSaccharina japonica(Phaeophyta) along the northwest coasts of the Pacific [J]. Journal of Applied Phycology, 2010, DOI 10.1007/s10811-010-9530-x.

[28]Bi Y H, Hu Y J, Zhou Z G. Genetic variation ofLaminaria japonica(Phaeophyta) populations in China as revealed by RAPD markers [J]. Acta Oceanologica Sinica, 2011, 30：103-112.

[29]汪文俊, 王廣策, 張寶玉, 等.海帶栽培品系和長(zhǎng)海帶ITS區(qū)的擴(kuò)增及序列分析[J].高技術(shù)通訊, 2005, 15(4)：95-101.

[30]Wang X L, Yang Y X, Cong Y Z, et al. DNA fingerprinting of selectedLaminaria(Phaeophyta) gametophytes by RAPD markers [J]. Aquaculture, 2004, 238：143-153.

[31]Zhang L S, Yang C G, Zhang Y, et al. A genetic linkage map of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei)：sex-linked microsatellite markers and high recombination rates [J]. Genetica, 2007, 131：37-49.

[32]Li X J, Yang G P, Shi Y Y, et al. Prediction of the heterosis ofLaminariahybrids with the genetic distance between their parental gametophyte clones [J]. Journal of Applied Phycology, 2008b, 20：1097-1102.

[33]Li Y H, Yang Y X, Liu J D, et al. Genetic mapping ofLaminaria japonicaandL. longissimausing amplified fragment length polymorphism markers in a “two-way pseudo-testcross” strategy [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2007, 49：392-400

[34]Yang G P, Sun Y, Shin Y Y, et al. Construction and characterization of a tentative Amplified Fragment Length Polymorphism-Simple Sequence Repeat linkage map ofLaminaria(Laminariales, Phaeophyta) [J].Journal of phycology, 2009, 45：873-878.

[35]Liu F L, Wang X L, Liu J D, et al. Genetic mapping of theLaminaria japonica(Laminariales, Phaeophyta)using amplified fragment length polymorphism markers[J]. Journal of Phycology, 2008, 45：1288-1233.

[36]Liu Y S, Li L H, Wu W K, et al. A SCAR molecular marker specifically related to the female gametophytes ofSaccharina(Laminaria)japonica(Phaeophyta) [J]. J Phycol, 2009, 45：894-897

[37]Liu F L, Yao J T, Wang X L, et al. Identification of SCAR marker linking to longer frond length ofSaccharina japonica(Laminariales, Phaeophyta) using bulked-segregant analysis [J]. Journal of Applied Phycology, 2010, DOI：10.1007/s10811 -010-9567-x.

[38]Liu F L, Shao Z R, Zhang H N, et al. QTL Mapping for Frond Length and Width inLaminaria japonicaAresch(Laminarales, Phaeophyta) Using AFLP and SSR Markers [J]. Marine Biotechnology, 2010a, 12：386-394.

[39]Qin S, Jiang P, Tseng C K. Transforming kelp into a marine bioreactor [J]. Trends in Biotechnology, 2005,23(5)：264-268.

[40]Jiang P, Qin S, Tseng C K. Expression of hepatitis B surface antigen gene(HBsAg) inLaminaria japonica(Laminariales, Phaeophyta) [J]. Chinese Science Bulletin. 2002, 47：1438-1440.

[41]武建秋, 王希華, 秦松, 等. 海帶基因工程選擇標(biāo)記的研究[J]. 海洋科學(xué), 1995, 19(5)：42-44.

[42]秦松, 王希華, 曾呈奎. 藻類的遺傳轉(zhuǎn)化[C]//植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù). 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,1994：79-82．

[43]Qin S, Jiang P, Li X P, et al. A transformation model forLaminaria japonica(Phaeophyta, Laminariales) [J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 1998,16 (Suppl.)：50-55.

[44]Jiang P, Qin S, Tseng C K. Expression of the lacZ reporter gene in sporophytes of the seaweedLaminaria japonica(Phaeophyceae)by gametophyte-targeted transformation[J]. Plant Cell Report, 2003, 12：1211-1216.

[45]秦松, 嚴(yán)小軍, 曾呈奎．藻類分子生物技術(shù)兩年評(píng)：基因工程及其上游―分子遺傳學(xué)[J]．海洋與湖沼,1996, 27：103-111.

S917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2012)09-0128-07

2011-11-10;

2011-12-10

國(guó)家 863 計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA10A406); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)(200903030); 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 2012 年度基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(20603022012014)

劉福利(1983-), 男, 山東濟(jì)寧人, 博士, 主要從事經(jīng)濟(jì)海藻遺傳育種和生態(tài)養(yǎng)殖研究, 電話：0532-85838673, E-mail：liufl@ysfri.ac.cn; 王飛久, 通信作者, 研究員, E-mail：wangfj@ysfri.ac.cn

張培新)