王秀秀, 章 軍

(1. 福建省陸海界面生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廈門大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院, 福建廈門 361005; 2. 廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福建廈門, 361005)

基于LC-MS/MS技術(shù)對藍(lán)藻Gloeobacter violaceusPCC 7421細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

王秀秀1, 章 軍2

(1. 福建省陸海界面生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廈門大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院, 福建廈門 361005; 2. 廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福建廈門, 361005)

Gloeobacter violaceusPCC 7421是一種在進(jìn)化上很古老的無類囊體藍(lán)藻, 由于光合作用電子傳遞鏈與呼吸系統(tǒng)在其細(xì)胞質(zhì)膜上共存, 這兩個(gè)系統(tǒng)可能會(huì)共享一些元件, 為研究其光合作用系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的獨(dú)特之處, 應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)對其細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn),G. violaceus的細(xì)胞質(zhì)膜上具有PSⅠ、PSⅡ和細(xì)胞色素b6等光合作用關(guān)鍵蛋白, 同時(shí)具有呼吸作用過程中的關(guān)鍵酶1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、F0F1- ATP酶α和β亞基、細(xì)胞分裂蛋白、硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、青霉素結(jié)合蛋白以及多種藥物受體ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。由此可知,G. violaceus的細(xì)胞質(zhì)膜不僅能夠同時(shí)進(jìn)行光合作用和呼吸作用, 且營養(yǎng)鹽運(yùn)輸?shù)绒D(zhuǎn)運(yùn)功能也同時(shí)存在。G. violaceus的全基因數(shù)據(jù)分析顯示其基因序列具有獨(dú)特性, 其蛋白注釋相對比較少, 因此其蛋白功能的研究需要更多數(shù)據(jù)的支持。

Gloeobacter violaceusPCC 7421; LC-MS/MS; 細(xì)胞質(zhì)膜

蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來在海洋生物中的研究熱點(diǎn),在細(xì)菌[1]、貝類[2]、節(jié)肢動(dòng)物[3]和赤潮藻類[4]方面都有廣泛的應(yīng)用。Gloeobacter violaceusPCC 7421是一種古老的無類囊體自養(yǎng)藍(lán)藻, 16S rDNA分子發(fā)育樹分析表明, 它是藍(lán)細(xì)菌與葉綠體在分枝之后最早的生物[5]。它具有一系列的獨(dú)一無二的特性：它沒有類囊體膜, 而且顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)光合作用元件定位在其細(xì)胞質(zhì)膜上[6], 其細(xì)胞質(zhì)膜不僅是細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的半透性屏障, 還是其光合作用的場所。由于光合作用電子傳遞鏈與呼吸系統(tǒng)在其細(xì)胞質(zhì)膜上共存, 這兩個(gè)系統(tǒng)可能會(huì)共享一些元件[7], 例如質(zhì)體醌(PQ)等, 且兩種系統(tǒng)的電子傳遞鏈可能重疊[8]。因此該藻細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)種類及其定位的選擇必然具有其重要的生物學(xué)意義, 其光合作用系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能必然有其獨(dú)特之處。因此進(jìn)行G. violaceus細(xì)胞質(zhì)膜蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)分析是十分有意義的。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用 (LC-MS/MS) 技術(shù)是近年來廣泛使用的高通量高靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法, 在定量分析和低豐度蛋白的分離分析方面, LC-MS/MS比起雙向電泳技術(shù)為基礎(chǔ)的凝膠水平的分離分析更加便利和準(zhǔn)確[9]。因此, 我們運(yùn)用LC-MS/MS技術(shù)對G. violaceus細(xì)胞質(zhì)膜上蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究, 用以揭示其細(xì)胞質(zhì)膜上相關(guān)蛋白質(zhì)的種類, 為今后的蛋白功能和定位研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 藻類的培養(yǎng)

G. violaceusPCC 7421由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微藻分子與基因工程實(shí)驗(yàn)室保存。將G. violaceusPCC 7421按1∶50的比例接種于新鮮配制的BG-11培養(yǎng)基中, 28 ℃靜置培養(yǎng), 24 h連續(xù)光照, 光照強(qiáng)度為 80 μmol/(m2·s), 到對數(shù)生長期時(shí)收集藻體用于提取膜蛋白。

實(shí)驗(yàn)中使用的所有水均為Milli-Q水, 所有試劑均為分析純, 乙腈(ACN)為色譜純, 胰酶(Sigma公司)為測序純。

1.2 膜蛋白的提取

將200 mL對數(shù)期藻細(xì)胞于Beckman 高速冷凍離心機(jī)中離心收集, 條件為8 000g, 4 ℃, 離心時(shí)間為 10 min。離心結(jié)束后去上清, 用無菌的生理鹽水(0.85%)重懸沉淀后再次離心收集, 條件同上。離心結(jié)束后取沉淀, 將沉淀在緩沖液中進(jìn)行超聲波破碎,當(dāng)鏡檢后 99%的細(xì)胞無細(xì)胞結(jié)構(gòu)后停止。細(xì)胞破碎后, 離心去除未破碎的細(xì)胞, 離心條件為12 000g, 4℃, 離心時(shí)間 10 min, 離心結(jié)束后取上清即為細(xì)胞全蛋白樣品。

膜蛋白的提取方法依據(jù)Gutmann的方法進(jìn)行[10]。在 Beckman超速離心機(jī)中, 將全細(xì)胞蛋白樣在100 000g, 4 ℃, 離心時(shí)間為40 min的條件下離心,離心結(jié)束后將上清盡量去除干凈, 取沉淀即為膜蛋白粗樣。將膜蛋白粗樣在20 mL預(yù)冷的10%三氯乙酸-丙酮中沉淀,于–20 ℃冰箱中沉淀過夜,去除色素等干擾組分。期間數(shù)次漩渦振蕩, 盡量使沉淀在三氯乙酸-丙酮中分布均勻。沉淀結(jié)束后離心收集沉淀,條件為12 000g, 4 ℃, 離心時(shí)間20 min。離心結(jié)束后用預(yù)冷的丙酮重懸沉淀, 再次離心取沉淀, 條件同上。多次重復(fù)直至上清為無色, 即認(rèn)為色素等干擾物已經(jīng)去除干凈, 將沉淀在超凈工作臺(tái)中吹干, 即為膜蛋白樣品。

1.3 酶切

將干燥的蛋白溶解于200 μL的含有6 mol/L鹽酸胍, 50 mmol/L Tris溶液中(pH 8.3), 然后加入2 μL的1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)?；旌衔镌?7 ℃孵育2.5 h, 然后加入 10 μL的0.8 mol/L 碘乙酸(IAA)溶液, 避光室溫孵育40 min。在此之后, 高速冷凍離心機(jī)內(nèi)在11 000g, 6℃, 90 min條件下將蛋白溶液通過3 K超濾管(Millipore公司), 并交換到50 μmol/L碳酸氫氨溶液中(pH 8.5), 并加入 15 μg胰蛋白酶在37 ℃孵育過夜。未酶切的蛋白和胰蛋白酶通過10 K超濾管去除(條件同上)。消化的多肽混合物在冷凍離心干燥后溶解在 20 μL 0.5%的甲酸(FA)溶液中, 其中10 μL用于質(zhì)譜分析。

1.4 LC-MS/MS方法鑒定膜蛋白

液相色譜-電噴霧線性離子阱質(zhì)譜(LC-ESI-MS)分析使用LTQ (ThermoFisher Scientific)質(zhì)譜儀。色譜分析柱為75 μm ID, 10 cm長的C18反相柱, 流動(dòng)相為 A：0.1% FA/H2O, B：0.1% FA/ACN, 分流前流速為120 μL/min, 分流后為 2 μL/min。ESI針電壓為 3.0 kV,歸一化碰撞能量為 35%。數(shù)據(jù)采集使用數(shù)據(jù)依賴模式, 包括一個(gè)完整的 MS掃描, 核質(zhì)比從 400到1 800, 收集10個(gè)最高豐度的離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離,得到二級(jí)譜圖用于多肽鑒定。動(dòng)態(tài)排除參數(shù)為：重復(fù)計(jì)數(shù)2次, 重復(fù)時(shí)間30 s, 排除期120 s。

1.5 數(shù)據(jù)庫搜索

串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用 SEQUEST算法, 在G.violaceusPCC 7421全基因組FASTA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索, 假陽性率為≤1%。

1.6 蛋白功能注釋以及亞細(xì)胞定位網(wǎng)址

蛋白功能Uniprot數(shù)據(jù)庫中注釋, 蛋白亞細(xì)胞定位在PSORTb(版本3.0.2)網(wǎng)站搜索。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-ESI-LTQ質(zhì)譜譜圖

G. violaceus的LC-ESI-LTQ譜圖如圖1所示, 從圖中可以看出,G. violaceus蛋白分離清晰, 信號(hào)強(qiáng)度較高, 蛋白分離效果良好, 且存在數(shù)個(gè)高豐度蛋白。

圖1 G. violaceus PCC 7421膜蛋白液相色譜圖Fig. 1 LC-ESI-LTQ maps of membrane proteins of G.violaceus PCC 7421

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

經(jīng)過數(shù)據(jù)庫搜索, 共鑒定出 36種(38個(gè))G.violaceus蛋白, 見表1所示。

2.3 蛋白亞細(xì)胞定位

分析得到的蛋白的亞細(xì)胞定位如圖2所示, 經(jīng)過在線程序 PSORTb(版本 3.0.2)的亞細(xì)胞定位分析,分離得到的蛋白中 54%的蛋白為質(zhì)膜蛋白(21個(gè)),31%的蛋白為胞漿蛋白(11個(gè)), 15%的蛋白為未知定位的蛋白(6個(gè))。

表1 G. violaceus PCC 7421膜蛋白LC-ESI-LTQ鑒定結(jié)果Tab. 1 LC-ESI-LTQ results of membrane proteins of G. violaceus PCC 7421

在質(zhì)膜蛋白中包含PSⅠ的A2蛋白, PSⅡ的D1蛋白, 細(xì)胞色素b6, 全部的ATP相關(guān)蛋白(3個(gè))、細(xì)胞分裂蛋白、硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白以及聚酮合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶等。胞漿蛋白中主要包括1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶、核苷酸磷酸化酶、RNA合成酶和核糖體亞基。

圖2 已鑒定蛋白亞細(xì)胞定位分布圖Fig. 2 Subcellular localizations of the identified proteins

2.4 蛋白動(dòng)能分類

根據(jù)蛋白功能分類, 將蛋白分為 11類, 如圖3所示：

圖3 細(xì)胞質(zhì)膜已鑒定蛋白功能分布圖Fig. 3 Functions of the identified membrane proteins

如圖3所示, 已鑒定的蛋白中根據(jù)功能分類, 主要為光合作用相關(guān)蛋白(7個(gè))、碳固定相關(guān)蛋白(1個(gè))、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(5個(gè))、ATP酶(3個(gè))、蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白(4個(gè))、核酸合成相關(guān)蛋白(2個(gè))、脂類合成相關(guān)蛋白(1個(gè))、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白(2個(gè))、細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白(1個(gè))、其他功能(5個(gè))以及未知功能蛋白(8個(gè))。

3 討論

雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)最早使用的分離技術(shù),但是由于它對堿性端的蛋白分離效果比較差, 特別是對低豐度蛋白的分離效果有限, 更加凸顯了LC-MS/MS方法的優(yōu)勢, 如圖1所示, LC-ESI/LTQ質(zhì)譜的結(jié)果比較理想, 分離得到的蛋白強(qiáng)度較高, 分離效果較好, 且鑒定得到的蛋白其等電點(diǎn)從4.62～9.84, 分子量從9 kD到221 kD, 分布非常寬泛(表1), 這種方法的精度高且對堿性蛋白的分離效果好, 再加上二級(jí)質(zhì)譜對低豐度蛋白具有很好的信號(hào)放大作用, 操作簡便, 且省時(shí)省力, 因此利用LC-MS/MS法在藍(lán)藻膜蛋白的分離鑒定方面非常可行。由于LC-MS/MS的方法是在蛋白分離之前酶解,免除了在割膠時(shí)可能帶進(jìn)去污染的問題, 但也造成了分析質(zhì)譜結(jié)果時(shí)的假陽性增高的缺點(diǎn), 因此在數(shù)據(jù)分析時(shí)必須嚴(yán)格設(shè)定搜庫條件, 假陽性率為≤1%,提高數(shù)據(jù)可信度。

藍(lán)藻中含量最大的蛋白是藻藍(lán)蛋白, 從圖3可以看出, 使用超速離心的方法可以富集膜蛋白, 去除大部分藻藍(lán)蛋白。提取得到的G. violaceusPCC 7421的膜蛋白中經(jīng)鑒定膜蛋白的比率為 54%, 主要是光合作用相關(guān)蛋白、ATP酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。胞漿蛋白占所提取蛋白中的 31%, 主要是與核酸和蛋白質(zhì)合成過程有關(guān)的蛋白, 同時(shí)也有部分胞漿蛋白是與光合作用相關(guān)的蛋白, 如 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶, 這一酶蛋白本身是沒有跨膜結(jié)構(gòu)的,它們很可能是在執(zhí)行功能時(shí)附在膜上而同時(shí)被分離出來。

2003年 Nakamura的基因組數(shù)據(jù)報(bào)道[7],G.violaceus具有4 324個(gè)可編碼蛋白的基因, 其中僅有1 301個(gè)基因與其他藍(lán)藻具有相似性, 并且其中610個(gè)基因?yàn)樗{(lán)藻特有基因(在已知基因組數(shù)據(jù)的藍(lán)藻,包括Synechocystissp. PCC 6803,Anabaenasp. PCC 7120和Thermosynechococcus elongatusBP-1中), 高達(dá)一半的基因是未知功能的基因。因此,G. violaceus的基因注釋比較困難。根據(jù)G. violaceus的液相譜圖來看, 我們提取到的蛋白種類豐富, 但全范圍二級(jí)質(zhì)譜后匹配得到的蛋白只有38個(gè)(36種), 比預(yù)想的數(shù)據(jù)低, 且 15%的蛋白為假想蛋白(6/38), 這一結(jié)果可能是由于G. violaceus的基因信息比其他模式藍(lán)藻少, 又兼其基因序列的獨(dú)特性, 它的全基因組序列注釋工作比較困難, 因此可供查詢的蛋白質(zhì)序列庫的信息不全, 因此對G. violaceus基因和蛋白質(zhì)序列的生物信息學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)需要更大力度地開展, 用以解開這一古老生物的蛋白編碼之謎。

2003年G. violaceusPCC 7421的全基因組序列的公布, 對G. violaceus的具有光合系統(tǒng)的質(zhì)膜的研究成為一個(gè)熱點(diǎn)。Inoue等[11]發(fā)現(xiàn)G. violaceus的PSⅠ中含有 9個(gè)亞基, 其他藍(lán)藻含有 12個(gè)亞基, 其亞基的數(shù)量較其他藍(lán)藻相比有所減少, 并具有獨(dú)特的PsaZ亞基。同時(shí), 其PSⅠ第二個(gè)電子受體是甲基萘醌類, 而不是常見的葉綠醌[12]。Mimuro[12]發(fā)現(xiàn)在–196℃下,G. violaceus的光合作用復(fù)合物缺乏PSⅠ的葉綠素?zé)晒? PSⅡ是獨(dú)特的可以利用光能氧化兩分子水產(chǎn)生一份子氧氣的蛋白復(fù)合物。Koyama等[13]發(fā)現(xiàn)雖然G. violaceus的PSⅡ系統(tǒng)的蛋白氨基酸序列有所變化, 并且在細(xì)胞質(zhì)膜上進(jìn)行, 但是最基本的水氧化反應(yīng)過程是高度保守的。Sicora等[14]研究發(fā)現(xiàn)G. violaceus具有5個(gè)PSⅡ的D1蛋白(psbA)基因,并且會(huì)調(diào)動(dòng)至少其中 3個(gè)支持其 PSⅡ的修復(fù)循環(huán),并且可以快速清除沒有光活性的D1蛋白。我們的結(jié)果同時(shí)鑒定到了PSI的A2蛋白和PSⅡ的D1蛋白,沒有鑒定到PsaZ蛋白, 可能是因?yàn)榈鞍诐舛蓉S度較低。也只鑒定出一種D1蛋白, 可能是由于鑒定得到的肽段是5種 D1蛋白的相同功能結(jié)構(gòu)域中的蛋白,鑒定得到5種不同的D1蛋白可能需要具體的分離純化得到PSⅡ蛋白復(fù)合體再進(jìn)行蛋白的種類鑒定。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶是與呼吸作用有關(guān)的酶。它是光合作用中卡爾文循環(huán)里催化第一個(gè)主要的碳固定反應(yīng), 將大氣中游離的二氧化碳轉(zhuǎn)化為生物體內(nèi)儲(chǔ)能分子, 它所催化的反應(yīng)是無機(jī)態(tài)的碳進(jìn)入生物圈的主要途徑[15]。茄呢酰二磷酸酯合酶的催化產(chǎn)物輔酶 Q(ubiquinone)結(jié)合蛋白質(zhì)的輔基(或輔酶)部分, 在呼吸鏈上不斷地被氧化和還原, 起著傳遞氫(遞氫體)或電子(遞電子體)的作用[16]。核糖體蛋白鑒定出30S小亞基一個(gè)蛋白, 硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等典型質(zhì)膜蛋白也有得到鑒定。

綜上所述, 我們的鑒定結(jié)果包含了G. violaceus光合作用系統(tǒng)、呼吸作用系統(tǒng)和電子傳遞鏈的關(guān)鍵蛋白, 以及藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白等光捕獲蛋白亞基, 核糖體亞基, 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基, 以及有關(guān)蛋白質(zhì)合成、核酸合成、脂類合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂和代謝相關(guān)的多種功能的蛋白, 為今后G. violaceus膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)行了初步的探索, 有待于今后開展更深入的研究解決這些問題。

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LC-MS/MS analysis of plasmic membrane proteins inGloeobacter violaceusPCC 7421

WANG Xiu-xiu1, ZHANG Jun2
(1. Fujian Provincial Key Laboratory of Coastal Ecology and Environmental Studies,College of the Environment and Ecology, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. Collge of life Science, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Apr.,10,2012

Gloeobacter violaceusPCC 7421; LC-MS/MS; plasma membrane

Gloeobacter violaceus, which lacks thylakoids, is the earliest branched cyanobacteria in the phylogenetic tree. Photosynthetic and respiratory systems coexist in its plasma membrane. To study of feature of the protein location of photosynthetic and respiration systems, we isolated and used LC-MS/MS to analyze plasma membrane proteins ofG. violaceusPCC 7421. The results showed this species had critical photosynthetic reaction center complexes proteins, such as photosystem II protein D1, photosystem I P700 chlorophyllaapoprotein A2, cytochrome b6, and allophycocyanin beta subunit. The ribulose bisophosphate carboxylase was also identified. The ATP synthesis subunits, cell division proteins and nitrate transporters were identified at the same time. Therefore, the plasma membrane not only could carry out photosynthesis and respiration, the nutrient transport and other transport function also existed. Because of the low similarity of its gene with other organisms, many proteins were difficult to be annotated.

Q946 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2012)09-0039-06

2012-04-10;

2012-07-11

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010J01232)

王秀秀(1982-), 女, 河北張家口人, 博士研究生, 主要研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)學(xué), E-mail：xiuxiuwang0420@126.com; 章軍, 通信作者, 副教授, 研究方向?yàn)槲⒃寤蚬こ碳暗鞍踪|(zhì)組學(xué), E-mail：jzhang@xmu.edu.cn

張培新)