韋莉，魏立雯，賴國旗，譚毅，張文露，潘永全

(1.重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，重慶 400016;2.感染性疾病分子生物學重點實驗室，重慶 400016)

金黃色葡萄球菌是一種人獸共患病病原體，屬于革蘭陽性球菌，廣泛存在于自然界，可以引起人和其他動物的各種疾病，如，化膿性關節(jié)炎、肺炎、心內膜炎、腦膜炎、蜂窩織炎、骨髓炎等［1］，臨床表現(xiàn)以呼吸道、皮膚、軟組織感染為主。金黃色葡萄球菌感染，將嚴重影響實驗動物質量和動物實驗結果［2］。實驗動物是生命科學研究中四要素之一，我國實驗動物微生物控制國家標準明確規(guī)定，嚙齒類實驗動物SPF 級不能攜帶金黃色葡萄球菌，因此在引種、飼養(yǎng)和繁殖過程中，必須定期對嚙齒類SPF 級實驗動物進行金黃色葡萄球菌檢測，以保障實驗動物的質量、動物實驗結果的準確和實驗動物工作人員的健康。目前，檢測金黃色葡萄球菌方法有很多，如國家標準方法GB/T14926.14－2001(以下簡稱GB 方法)、PCR 方法等［3］。GB 方法比較費時費力，而PCR 方法的假陽性又較高。本文根據(jù)反向線性雜交原理，建立金黃色葡萄球菌反向線性雜交探針檢測方法，用于實驗動物質量檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

腸道菌總DNA 抽提試劑盒(上海華舜生物技術有限公司，中國)，質粒提取試劑盒(道普生物科技(北京)有限公司，中國)，堿性磷酸酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，中國)，pMD18－T Vector 試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司，中國)，生物素抗體－堿性磷酸酶(AP)(Roche 公司，瑞士)，硝酸纖維膜(Millpore 公司，美國)。S1000TM Thermal cycler PCR 儀和凝膠成像儀(BioRad 公司，美國)，3100 測序儀(ABI 公司，美國)，XYZ3050F劃膜儀(Biodot 公司，美國)。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌標準菌株25923、沙門菌、鏈球菌、大腸埃希氏菌、綠膿桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌由重慶醫(yī)科大學檢驗系提供，大腸桿菌E.coli DH5α 由本室保存。

1.1.3 實驗動物

42 只清潔級KM 小鼠和32 只清潔級SD 大鼠，雌雄各半，體重20～22 g，來源于重慶醫(yī)科大學實驗動物動物中心【SCXK(渝)2007－0001】。實驗是在重慶醫(yī)科大學實驗動物中心動物實驗屏障環(huán)境中進行【SYXK(渝)2007－0001】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 方法

1.2.1 通用引物與特異性探針設計及PCR 擴增

根據(jù)GenBank 中公開發(fā)表的金黃色葡萄球菌nuc 基因序列(GenBank:NC_002758.2)，設計如下一對通用引物［4］及特異性探針:

NucF1: 5′－Bio－GCCGAATTCGTTATGACAGAATACT－3′

Nuc R1:5′－Bio－CAAGTCGACCAGCGTTGTCTTCGC－3′

探針1:5′－GCCATACATATGCCAGC－3′

探針2:5′－CACTTGCTTCAGGACCA－3′

1.2.2 感受態(tài)制備

將DH5 α 菌液冰上放置10 min，分裝至1.5 mL EP 管，每管1 mL;4℃，4000 g 離心10 min。棄掉上清液，加入600 μL 氯化鈣，重懸細胞沉淀，4℃，4 000 g 離心10 min，棄掉上清液，加入40 μL 氯化鈣，重懸細胞沉，每管100 μL，置－80℃保存。

1.2.3 T 載體連接及轉化

pMD18－T vector 1 μL，PCR 產物2 μL，蒸餾水2 μL，solution I 5 μL。全量加入100 μL 感受態(tài)，冰中放置30 min，42℃加熱45 s，冰中放置1 min，加890 μL LB 液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min，1h。將菌液離心后，于氨芐抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h，篩選菌落并按質粒提取試劑盒說明書提取質粒。

1.2.4 PCR 擴增

在50 μL 反應體系中分別加入PCR Premix 25 μL Nuc F1、Nuc R1 引物各1 μL，(25 μmol/L)，模板DNA 2 μL，滅菌超純水21 μL，進行PCR 擴增。PCR 擴增循環(huán)參數(shù)為94℃預變性5 min;94℃45 s，62℃30 s，72℃45 s，30 個循環(huán);72℃延伸7 min。

1.2.5 雜交膜的制備

將PCR 擴增產物稀釋成3 ng/μL，將Nuc F1、探針1、探針2 配制成50 μmol/L，用劃膜儀按PCR產物、生物素標記的引物、探針1、探針2 順序線性噴灑于硝酸纖維膜上(圖1)，膜片經(jīng)紫外交聯(lián)后，120℃烘烤30 min，室溫干燥保存。

1.2.6 雜交條件優(yōu)化

按雜交膜的制備方法將兩條3′、5′端用不同bp dC(10C、15C、20C)對稱修飾的探針制備反向線性雜交試紙條，試紙條浸泡在2 mL 45℃預熱的雜交液(6 ×SSC，0.1% SDS)中，加入20 μL PCR 變性產物(10 μL 標準質粒PCR 產物、10 μL 變性液，室溫混合處理10 min)，37℃，40℃或43℃雜交30 min，60 min 或120 min。

1.2.7 洗膜和顯色

雜交完成后，用雜交液室溫漂洗2 min，洗脫液(0.5 × SSC，0.1% SDS)50℃洗脫30 min，TBS 室溫漂洗5 min。將膜片浸泡于2 mL 生物素抗體堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)溶液(含TTBS 2 mL、BSA 0.1g、AP0.4 μL)中，28℃30 min，然后用TBS 室溫漂洗5 min，顯色緩沖液25℃洗膜5 min。最后將膜浸入2 mL NBT/BCIP 顯色液(顯色緩沖液2 mL，NBT/BCIP 40 μL)中，28℃避光顯色30 min，蒸餾水終止反應，根據(jù)紫色線條出現(xiàn)的位置和順序直接判斷結果。

1.2.8 雜交特異性及靈敏性檢測

雜交特異性:分別提取金黃色葡萄球菌標準菌株25923、沙門菌、鏈球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌基因組DNA，用制備好的反向線性探針試紙條進行雜交并顯色，分析檢測結果。

雜交靈敏性:將金黃色葡萄球菌標準菌株PCR擴增產物按200、20、2、0.2 ng/μL 進行稀釋，用制備好的反向線性探針試紙條進行雜交并顯色，分析檢測結果檢測。

1.2.9 臨床樣本檢測

用新建立的反向探針方法和GB 方法同時檢測42 只清潔KM 小鼠和32 只SD 大鼠。分析兩種方法的檢測結果。

1.2.10 統(tǒng)計方法

用SPSS 11.5 軟件進行數(shù)據(jù)分析。當P＜0.05時，即為統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Nuc 基因的擴增

金黃色葡萄球菌標準菌株25923PCR 產物經(jīng)T載體克隆后，篩選陽性克隆，于氨芐抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 h，進行菌液PCR 擴增，在678 處可見陽性條帶，與預期片段大小一致(圖1)。經(jīng)過測序，其結果與NCBI 中的序列一致。

圖1 nuc 基因DNA 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳Note:The nuc was inserted into T vecter，and the bacteria DNA was assessed by PCR.The DNA amplification products were 678 bp as expected.M:1000 bp marker;1～15:PCR products.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of amplification products of the nuc gene

2.2 雜交條件優(yōu)化

將兩條探針的3′、5′端對稱用不同bp 的dC 修飾(10 C、15 C、20 C)，在3 個溫度(37℃、40℃、43℃)下雜交不同時間(0.5、1、2 h)，在28℃條件下與不同的AP 抗體濃度(1 ∶15 000、1 ∶10 000、1∶5 000)結合，結果發(fā)現(xiàn)15C 修飾的探針、雜交溫度為37℃、雜交時間60 min、抗體濃度為1∶5000 信號強度最好，且無非特異性條帶出現(xiàn)。

2.3 雜交檢測的特異性

應用建立的反向線性雜交方法，檢測金黃色葡萄球菌標準菌株25923、沙門菌、鏈球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌基因組DNA，雜交試驗結果顯示，所有試紙條的顯色對照和通用引物均為陽性顯色，金黃色葡萄球菌25923 探針1 和探針2 出現(xiàn)明顯的陽性顯色，而其他菌株雜交結果均為陰性(圖2)。

2.4 雜交檢測的靈敏性

用制備好的試紙條檢測不同濃度標準質粒PCR 產物，PCR 產物濃度為2 ng/μL 時，能被檢出(圖3)。

圖2 金黃色葡萄球菌反向線性雜交特異性檢測Note:1.PCR products of SA hybridization;2－9.PCR products of hybridization of Sarmonella，Streptococcus，E.coli，Pseudomonas aeruginosa，Proteus，dysentery bacilli，Bacillus subtilis，Staphylococcus epidermidis;10.Negative control.Fig.2 Specificity of RLH detection of Staphylococcus aureus

2.5 臨床樣本檢測

應用本文建立的反向雜交探針的方法與GB 方法(見圖4，彩插10)同時對清潔級小鼠和大鼠進行檢測，結果顯示，兩種檢測方法結果完全一致，均為陰性，P ＞0.5，差異無顯著性。

圖3 金黃色葡萄球菌反向線性雜交靈敏度檢測Note:1:20 ng/μL，2:2 ng/μL，3:0.2 ng/μL;4:0.02 ng/μLFig.3 Sensitivity of reverse linear hybrid detection of Staphylococcus aureus

3 討論

實驗動物是經(jīng)人工飼育，對其攜帶的微生物、寄生蟲實行控制，遺傳背景明確或者來源清楚的，用于科學研究、教學、生產、檢定及其他科學實驗的動物，是生物醫(yī)學研究中的“活試劑”。實驗動物質量好壞，將嚴重影響動物實驗結果。實驗動物發(fā)生金黃色葡萄球菌的感染，其產生的腸毒素將會對實驗動物的生化指標產生影響，從而導致實驗結構不穩(wěn)定?？焖?，特異、靈敏、準確地檢測金黃色葡萄球菌，對保證實驗動物質量具有重要意義。

在我國GB149242－2001 實驗動物微生物質量國家標準中，對金黃色葡萄球菌的檢測采用傳統(tǒng)的細菌學檢測方法，這是檢測金黃色葡萄球菌的金標準，其檢測過程包括采樣、菌落鑒定等，操作復雜，耗時費力。

反向雜交技術又名基因探針技術或核酸分子雜交技術，其原理是在已知的引物片段上加上可識別的標記(如同位素標記、生物素標記)，進行PCR 擴增，使PCR 產物與核酸探針雜交，用以檢測未知樣品是否具有與其相同的序列［5］。近年來，Candice等［6］已經(jīng)將反向線性探針的方法用于病原微生物的檢測，取得了一定的成就。

nuc 基因序列是編碼耐熱核酸酶的基因，為金黃色葡萄球菌所特有，而且在不同菌株之間具有較高的保守性［7］。本文根據(jù)nuc 基因序列設計通用引物及特異性探針，擴增目的片段，建立了反向線性探針檢測的方法。該方法與GB 方法比較，本方法快速，整個檢測過程僅需1 d 時間，GB 方法至少需要2～3 d;經(jīng)過標準菌株PCR 產物系列稀釋檢測和不同菌株的PCR 產物的檢測，其檢測限為2 ng/μL，檢測特異性為100%。表明該方法檢測靈敏度高，特異性好。同時，通過對74 只實驗動物進行檢測，其檢測結果與傳統(tǒng)分離方法一致，其準確性為100%。本方法克服了GB 方法操作繁瑣、耗時、費力和檢出率低等缺點。與PCR 比較，本方法結果判斷依據(jù)為:在顯色控制及通用引物均顯色的情況下，如果一條探針顯色為陽性，則其結果判為可疑;如果兩條探針顯色為陽性，則其結果判為陽性，避免了PCR 檢測方法假陽性的不足。同時，本文采用無放射性危險的生物素將探針進行標記，較為安全可靠，且顯色效果好，克服了用放射性同位素標記的核酸探針雖然靈敏度高，但存在放射性危害、價格昂貴、半衰期短和不穩(wěn)定等不足。

本研究所建立的反向探針線性雜交方法具有較強的特異性和較高的敏感性，檢測結果簡潔、直觀，操作時無放射性污染，為實驗動物的引種、飼養(yǎng)和繁殖過程中金黃色葡萄球菌的檢測提供了一種快速、敏感、特異、安全和經(jīng)濟的新的檢測手段。

(本文圖4 見彩插10)

圖4 傳統(tǒng)方法對金黃色葡萄球菌檢測結果Note: A.The growth of SA in SP(mannitol and sodium chloride agar medium);B.The growth of SA in blood agar(alpha hemolysis);C.Gram staining(Gram-positive cocci);D.Gas production in mannitol mediumFig.4 Detection results of Staphylococcus aureus by traditional methods

［1］于恩庶，林繼煌，陳觀今.中國人獸共患病學［M］.1996，福州:福建科學出版社，

［2］蕭佩蘅，劉瑞三，催中道，等.實驗動物醫(yī)學［M］.1992，北京:農業(yè)出版社.

［3］Aydiner A，Lüsebrink J，Schildgen V，et al.Comparison of two commercial PCR methods for methicillin－resistant Staphylococcus aureus(MRSA)screening in a tertiary care hospital［J］.PLoS One，2012，7(9):e43935.

［4］高正琴，邢華，李厚達.PCR 技術在檢測鼠金黃色葡萄球菌中的應用研究［J］.中國實驗動物學報，2003，11(1):26－28.

［5］焦偉偉，李墨，Mokrousov I，等.應用反向線性雜交技術快速檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性研究［J］.標記免疫分析與臨床，2007，3(14):18－21.

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