劉峰林，任遠(yuǎn)，吳國(guó)泰，王瑞瓊，魏彥明

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070;2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育基地)，蘭州 730000)

離體氣管法是常用的篩選平喘藥的實(shí)驗(yàn)方法之一，常選用豚鼠氣管作為實(shí)驗(yàn)材料，因豚鼠氣管對(duì)乙酰膽堿和組胺引發(fā)收縮敏感，目前文獻(xiàn)報(bào)道也有用家兔氣管和大鼠作為實(shí)驗(yàn)材料［1－3］。常用的有氣管片、氣管環(huán)、氣管連環(huán)、氣管螺旋條和離體完整氣管法。引發(fā)氣管平滑肌收縮的激發(fā)藥物常選擇乙酰膽堿與組胺，也有根據(jù)探索藥物作用靶點(diǎn)與機(jī)理選擇白細(xì)胞三烯A4(上海有機(jī)所可以合成，文獻(xiàn)縮寫(xiě)為L(zhǎng)TA4，)［4］、腺苷受體激動(dòng)劑R－苯異丙基腺苷(Rphenyl－isopropyl－adenosine，R－PIA)［4，5］。實(shí)驗(yàn)中常選用氣管螺旋條法，因螺旋條法對(duì)平滑肌收縮引發(fā)藥物的敏感性較高［6］，但此法制備標(biāo)本時(shí)采用螺旋剪法制備，標(biāo)本的制作難度較大，對(duì)研究人員的手術(shù)水平要求高，制備的標(biāo)本間收縮反應(yīng)幅度差異較大，標(biāo)本制作差異往往對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果影響顯著。筆者擬降低氣管螺旋條標(biāo)本制作手術(shù)難度與減小離體標(biāo)本間差異，提高實(shí)驗(yàn)的精度，減小實(shí)驗(yàn)的誤差，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)效率，改進(jìn)螺旋剪法建立旋割法，并對(duì)該法制備的螺旋條與螺旋剪法制備的螺旋條收縮效應(yīng)加以比較，對(duì)旋割法標(biāo)本制備質(zhì)量加以評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料

乙酰膽堿、組胺由甘肅省中藥藥理與毒理省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室吳國(guó)泰贈(zèng)，用雙蒸水配成溶液備用。營(yíng)養(yǎng)液用克氏液(Kreb′s)含(mmol/L)∶NaCl 118.3，KCl 4.7，CaCl22.5，NaHCO325.0，KH2PO41.2，MgSO41.2，葡萄糖11.1，用雙蒸水配制，選用SPF級(jí)DHP 品種豚鼠40 只，雌雄各半，體重310～360 g，來(lái)源于蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(甘)2010－001 ，SYXK(甘)2010－001】，符合中國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的福利倫理準(zhǔn)則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用按3R 原則給予人道關(guān)懷。

BL－420 生物信號(hào)采集系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);傳感器(量程30 g 北京威信斯達(dá)儀器公司)，Sartorious BP110s(max =110 g，d =0.1 mg)天平。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備

螺旋剪法(spiral cutting with surgical scissors，SCWSS)制備標(biāo)本參照文獻(xiàn)［6］報(bào)道的方法，豚鼠頸椎脫臼法處死，取出豚鼠氣管，置于盛Kreb′s 液通O2玻璃皿中，迅速剝離周?chē)Y(jié)締組織，用一細(xì)玻棒穿入氣管，將氣管剪成約3 mm × 20 mm 的螺旋條。一端固定在玻璃鉤上，另一端固定在張力傳感器上，把氣管條置于盛有10 mL Kreb′s 液浴槽中，通以95% O2、5% CO2(V/V)的混合氣體，氣泡數(shù)每分鐘60 個(gè)，浴槽溫度保持在(37 ±0.5)℃，靜止張力維持依據(jù)本文2.1、2.2、2.3 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下表格調(diào)整，每30 min 換液1 次，平衡2 h 后，開(kāi)始用浴槽濃度2.00 ×10－4g/L 乙酰膽堿、浴槽濃度2.0 ×10－3g/L histamine 誘導(dǎo)收縮。旋割法(spiral cutting with surgical blade，SCWSB)制備標(biāo)本，豚鼠頸椎脫臼法處死，取出氣管，置于通入O2盛放Kreb′s 液的玻璃皿中，迅速剝離氣管周?chē)Y(jié)締組織，將手術(shù)刀片用膠固定在試驗(yàn)臺(tái)邊緣，刀刃向上，用一細(xì)玻棒穿入氣管，將氣管水平壓于手術(shù)刀刃上，刀刃方向與細(xì)玻璃棒螺旋旋轉(zhuǎn)軸心成60 度夾角，保持角度不變，螺旋旋轉(zhuǎn)玻棒，將氣管螺旋切割成約3 mm × 20 mm 的螺旋條，依本文螺旋剪法中所述將標(biāo)本固定于浴槽中，靜止張力維持依據(jù)本文2.1、2.2、2.3 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下表格調(diào)整，平衡2 h 后開(kāi)始用浴槽濃度2.000 ×10－4g/L 乙酰膽堿、2.000 ×10－3g/L histamine 誘導(dǎo)收縮。氣管條收縮張力通過(guò)張力傳感器采集，BI－420 生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄氣管條張力變化。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 不同方法制備標(biāo)本對(duì)乙酰膽堿和磷酸組胺誘導(dǎo)收縮效應(yīng)敏感性比較見(jiàn)表1。

表1 不同制備方法對(duì)乙酰膽堿和磷酸組胺誘導(dǎo)收縮效應(yīng)的影響(±s，n =9)Tab.1 Effects of different preparation procedures of isolated tracheal strips of guinea pigs on contraction induced by histamine or acetylcholine(±s，n =9)

表1 不同制備方法對(duì)乙酰膽堿和磷酸組胺誘導(dǎo)收縮效應(yīng)的影響(±s，n =9)Tab.1 Effects of different preparation procedures of isolated tracheal strips of guinea pigs on contraction induced by histamine or acetylcholine(±s，n =9)

注:磷酸組胺浴槽濃度2.0 ×10 －3 g/L;乙酰膽堿2.0 ×10 －4 g/L;組間效應(yīng)比=旋割法收縮效應(yīng)/螺旋剪法收縮效應(yīng);標(biāo)本負(fù)荷2 g，螺旋剪法(SCWSS)與旋割法(SCWKB)組間比較，H 磷酸組胺誘導(dǎo)收縮組組間比較P＜0.05;A 乙酰膽堿誘導(dǎo)組組間比較P＜0.05。Note:Histamine concentration in bath 2.0 ×10 －3 g/L;Acetylcholine concentration in bath 2.0 ×10 －4 g/L;Effect ratio between groups = SCWSB contraction effect/SCWSS contraction effect;SCWSS:Spiral cutting with surgical scissors;SCWSB:Spiral cutting with surgical blade;HERBG:histamine effect ratio between groups;AERBG:Acetylcholine effect ratio between groups;H Comparison between histamine inducing contraction groups，P＜0.05;A Comparison between acetylcholine inducing contraction groups，P＜0.05.Samples tension 2 g.

組別Groups收縮效應(yīng)(g)Contraction磷酸組胺Histamine乙酰膽堿Acetylcholine磷酸組胺組間效應(yīng)比HERBG乙酰膽堿組間效應(yīng)比AERBG旋割法SCWSB0.581 ±0.127H0.663 ±0.121 A螺旋剪法SCWSS0.443 ±0.1730.549 ±0.191 1.3121.208

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，旋割法與螺旋剪法磷酸組胺引發(fā)收縮效應(yīng)組間方差齊性檢驗(yàn)值HF =1.856，旋割法與螺旋剪法乙酰膽堿引發(fā)收縮效應(yīng)組間方差齊性檢驗(yàn)值A(chǔ)F =2.491，F(xiàn)0.05(8，8)=3.44，F(xiàn)＜F0.05(8，8)，P ＞0.05，認(rèn)為兩組間方差齊;組胺引發(fā)收縮值進(jìn)行組間t 檢驗(yàn)t =3.235，sig =0.012，HP＜0.05;乙酰膽堿引發(fā)收縮值組間t 檢驗(yàn)t =2.418，sig =0.042，AP＜0.05，可以認(rèn)為不同制備方法對(duì)組胺和乙酰膽堿引發(fā)氣管螺旋條收縮效應(yīng)影響顯著。

2.2 旋割法制備標(biāo)本不同負(fù)荷對(duì)乙酰膽堿和磷酸組胺誘導(dǎo)收縮效應(yīng)的穩(wěn)定性比較見(jiàn)表2。

表2 不同負(fù)荷對(duì)乙酰膽堿和磷酸組胺誘導(dǎo)收縮效應(yīng)的影響(±s，n =9)Tab.2 Effect of different tensions on the contraction of isolated tracheal strips of guinea pigs induced by histamine or acetylcholine(±s，n =9)

表2 不同負(fù)荷對(duì)乙酰膽堿和磷酸組胺誘導(dǎo)收縮效應(yīng)的影響(±s，n =9)Tab.2 Effect of different tensions on the contraction of isolated tracheal strips of guinea pigs induced by histamine or acetylcholine(±s，n =9)

注:浴槽濃度磷酸組胺2.0 ×10 －3 g/L;乙酰膽堿2.0 ×10 －4 g/L;組間效應(yīng)比=2 g 負(fù)荷收縮效應(yīng)/1 g 負(fù)荷收縮效應(yīng);2 g 負(fù)荷螺旋條與1 g負(fù)荷螺旋條組間比較，H 磷酸組胺誘導(dǎo)收縮組間比較P＜0.05;A 乙酰膽堿誘導(dǎo)收縮組間比較P＜0.05;Note:Histamine concentration in bath 2.0 ×10 －3 g/L;Acetylcholine concentration in bath 2.0 ×10 －4 g/L;Effect ratio between groups =(Group 2 g contraction effect)/(Group 1 g contraction effect);SCWSB:spiral cutting with surgical blade;HERBG:Histamine effect ratio between groups;AERBG:Acetylcholine effect ratio between groups;H Comparison between histamine inducing groups P＜0.05;A Comparison between acetylcholine inducing groups，P＜0.05.

組別Groups標(biāo)本制備Sample Preparation收縮效應(yīng)(g)Contraction磷酸組胺Histamine 乙酰膽堿Acetylcholine磷酸組胺組間效應(yīng)比HERBG乙酰膽堿組間效應(yīng)比AERBG 2 g tension旋割法SCWSB0.532 ±0.141H0.551 ±0.167 A 1 g tension旋割法SCWKB0.359 ±0.2190.399 ±0.249 1.4821.380

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，不同負(fù)荷組間磷酸組胺引發(fā)收縮效應(yīng)方差齊性檢驗(yàn)值HF =2.412，不同負(fù)荷組間乙酰膽堿引發(fā)收縮效應(yīng)組間方差齊性檢驗(yàn)值A(chǔ)F=2.223，F(xiàn)0.05(8，8)=3.44，F(xiàn)＜ F0.05(8，8)，P ＞0.05，認(rèn)為兩組間方差齊;組胺引發(fā)收縮值進(jìn)行組間T 檢驗(yàn)α =0.05，t =3.866，sig =0.022，HP＜0.05，差異具有顯著性;乙酰膽堿引發(fā)收縮值經(jīng)組間T 檢驗(yàn)α=0.05，t =2.714，sig =0.026，AP＜0.05，差異具有顯著性，可以認(rèn)為不同負(fù)荷對(duì)組胺和乙酰膽堿引發(fā)氣管螺旋條收縮效應(yīng)影響顯著。

2.3 不同方法制備標(biāo)本對(duì)乙酰膽堿和磷酸組胺誘導(dǎo)收縮效應(yīng)的重復(fù)性比較見(jiàn)表3。

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，旋割法組與螺旋剪法組磷酸組胺引發(fā)收縮效應(yīng)方差齊性檢驗(yàn)值HF =2.207，旋割法組與螺旋剪法組乙酰膽堿引發(fā)收縮效應(yīng)組間方差齊性檢驗(yàn)值A(chǔ)F = 2.492，F(xiàn)0.05(8，8)= 7.15，F(xiàn)＜F0.05(5，5)，P ＞0.05，認(rèn)為兩組間方差齊;組胺引發(fā)收縮效應(yīng)進(jìn)行組間T 檢驗(yàn)α =0.05，t =3.553，sig =0.016，HP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;乙酰膽堿引發(fā)收縮值組間t 檢驗(yàn)α = 0.05，t = 2.651，sig =0.045，AP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)組胺和乙酰膽堿引發(fā)的氣管螺旋條收縮效應(yīng)，可以認(rèn)為不同制備方法對(duì)重復(fù)激發(fā)氣管螺旋條收縮效應(yīng)值的相對(duì)偏差影響顯著。

表3 不同螺旋條制備方法對(duì)乙酰膽堿和磷酸組胺誘導(dǎo)收縮效應(yīng)的重復(fù)性比較(±s)Tab.3 Comparison of the reproducibility of different preparation procedures of isolated tracheal strips of guinea pigs on contraction induced by histamine or acetylcholine(±s)

表3 不同螺旋條制備方法對(duì)乙酰膽堿和磷酸組胺誘導(dǎo)收縮效應(yīng)的重復(fù)性比較(±s)Tab.3 Comparison of the reproducibility of different preparation procedures of isolated tracheal strips of guinea pigs on contraction induced by histamine or acetylcholine(±s)

注:浴槽濃度磷酸組胺2.0 ×10 －3 g/L;乙酰膽堿2.0 ×10 －4 g/L;旋割法螺旋條與螺旋剪法螺旋條重復(fù)利用收縮效應(yīng)組間比較，H 磷酸組胺誘導(dǎo)收縮組間比較P＜0.05;A 乙酰膽堿誘導(dǎo)收縮組間比較P＜0.05;每組標(biāo)本數(shù)n =2，負(fù)荷2 g，每只標(biāo)本重復(fù)利用3 次。Note:Histamine concentration in bath 2.0 × 10 －3 g/L;Acetylcholine concentration in bath 2.0 × 10 －4 g/L;SCWSB:Spiral cut with surgical blade;SCWSS:Spiral cut with surgical scissors;TRUS:Times of repeatedly using sample;H Comparison between histamine inducing groups，H P＜0.05;A Comparison between acetylcholine inducing groups，P＜0.05.Samples n =2 in each group，sample tension 2 g，each sample is used for 3 times.

組別Groups收縮效應(yīng)(g)Contraction磷酸組胺HistamineRSD/%乙酰膽堿AcetylcholineRSD/%旋割法SCWSB0.521 ±0.103H19.80.633 ±0.121A 19.1螺旋剪法SCWSS0.433 ±0.15335.30.517 ±0.19133.7

3 討論

離體氣管平滑肌實(shí)驗(yàn)常用來(lái)篩選具有松弛氣管平滑肌作用的藥物，也可以研究探索一些內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)其的松弛作用，已有文獻(xiàn)報(bào)道利用離體氣管條研究豬血管活性腸肽(VIP)與同系物PHI 對(duì)豚鼠離體氣管具有直接松弛作用［7］，人重組白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL 1ra)可劑量依賴性抑制或拮抗histamine、acetylcholine 和5 羥色胺(5－HT)引起的氣管收縮［8］，黃體酮能使兔的離體氣管平滑肌乙酰膽堿及CaCl2量效曲線明顯壓低［2］。離體氣管螺旋條實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)誤差的產(chǎn)生主要來(lái)自測(cè)量?jī)x器、動(dòng)物的個(gè)體差異、研究者的手術(shù)水平這三個(gè)因素，前兩個(gè)因素導(dǎo)致的誤差不可避免，測(cè)量?jī)x器產(chǎn)生與研究者的手術(shù)水平產(chǎn)生的誤差可以通過(guò)使用精密度更高的儀器與提高手術(shù)水平來(lái)減小，而動(dòng)物的個(gè)體差異的實(shí)驗(yàn)誤差屬于隨機(jī)誤差，這些誤差均影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)因?qū)嶒?yàn)誤差增大影響對(duì)其的正確判斷［9］，要獲得正確的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，就得增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，因此減小可以控制的實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)精度，可以節(jié)省動(dòng)物，以較低的成本獲得正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于離體氣管平滑肌去上皮致敏豚鼠氣管標(biāo)本對(duì)乙酰膽堿、組胺和氯化鈣的敏感性比未去上皮標(biāo)本為高，同樣濃度誘發(fā)的收縮幅度去上皮的氣管條高于未去上皮的標(biāo)本［10］。本研究通過(guò)改進(jìn)氣管條的制備技術(shù)，制備的氣管條較為均勻，對(duì)激發(fā)收縮的收縮幅度有所提高，氣管條洗凈藥物重復(fù)利用時(shí)，收縮幅度的穩(wěn)定性較好，但在實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本未進(jìn)行去上皮試驗(yàn)，是否通過(guò)去除上皮可以進(jìn)一步增加標(biāo)本的收縮幅度和提高收縮幅度的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步探討。

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