魏東，王國治

鼠疫F1蛋白原核分泌性表達(dá)及鑒定

魏東，王國治

目的構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)鼠疫菌 F1 抗原。方法用 PCR 方法擴(kuò)增出帶有信號(hào)肽的 F1 基因，將其克隆到表達(dá)載體 pET30a(+) 上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)；用 IPTG 誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，層析方法純化 F1 蛋白，測定其分子量、等電點(diǎn)、N 末端氨基酸序列，用 Western blot法檢測其抗原性。

結(jié)果根據(jù)雙酶切和 DNA 測序結(jié)果顯示，F(xiàn)1 基因成功連接到表達(dá)載體 pET30a(+) 中，F(xiàn)1 蛋白主要為分泌性可溶表達(dá)。測定純化后 F1 蛋白的相對分子量約為 15.6 kD，等電點(diǎn)為 4.15，N 末端氨基酸序列與理論序列一致。經(jīng) Western blot 鑒定，能被兔抗鼠疫菌 EV 株血清識(shí)別。

結(jié)論成功克隆并構(gòu)建了 F1 蛋白分泌性原核表達(dá)系統(tǒng)，所表達(dá)的重組 F1 蛋白具有較好的抗原性，為新型鼠疫疫苗研制提供基礎(chǔ)。

耶爾森菌，鼠疫； 克隆，分子； 基因表達(dá)

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）引起的烈性傳染病。鼠疫菌被列為重要的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑，一直受到高度重視。人類歷史上曾有3 次暴發(fā)流行，奪走數(shù)億人的生命。目前國內(nèi)外鼠疫疫情有逐漸活躍的趨勢[1]，2010年秋在我國西藏暴發(fā)了人間鼠疫，說明鼠疫流行有可能死灰復(fù)燃。

傳統(tǒng)鼠疫疫苗有兩種，一種是滅活疫苗，對腺鼠疫有一定的保護(hù)效果，但因其用強(qiáng)毒株生產(chǎn)，存在著安全性差、保護(hù)期短、接種反應(yīng)率高、不能有效預(yù)防肺鼠疫等問題[2-3]；另一種是減毒活疫苗，采用皮上劃痕接種，該方法無法定量接種，陽轉(zhuǎn)率低[4]。因此，迫切需要安全有效的新型鼠疫疫苗。

現(xiàn)有研究證明，鼠疫耶爾森菌免疫保護(hù)性抗原主要是莢膜蛋白抗原分子（fraction F1）和表面抗原（V）分子[5-6]。F1 抗原是一種莢膜蛋白，由 100 kb的 pFra 質(zhì)粒編碼，是鼠疫菌的特異性抗原之一。F1 抗原位于菌體表面，有抗吞噬作用，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，與抗鼠疫感染有密切關(guān)系，是制備新型疫苗不可缺少的成分。本研究構(gòu)建 pET-30a/F1重組表達(dá)質(zhì)粒菌株，并誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，通過層析純化，獲得了鼠疫 F1 重組蛋白抗原，為新型鼠疫疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌種及質(zhì)粒 大腸桿菌 DH5a 和 BL21(DE3)、質(zhì)粒 pET-30a(+) 均由本室保存。

1.1.2 分子生物學(xué)試劑 內(nèi)切酶NdeI、EcoR I、T4 DNA 連接酶、PyrobestDNA 聚合酶、DNA 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒 DNA 小量純化試劑盒均為日本 TaKaRa 公司產(chǎn)品。

1.1.3 其他鼠疫專用試劑 鼠疫菌 DNA 模板及鼠疫診斷血清（批號(hào) 20020501）均由蘭州生物制品研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的序列（Gene-Bank：X61996）用 Oligo6.0 軟件設(shè)計(jì)引物。F1 上游引物：5′ GGCGAGTCCATATGAAAAAAA TCAGTTCC 3′；F1 下游引物：5′ CCGGAATTCTT ATTGGTTAGATACGGT 3′；下劃線分別為NdeI、EcoR I 酶切位點(diǎn)。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增 F1 抗原結(jié)構(gòu)基因 以鼠疫菌DNA 為模板，以 F1 上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃l min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將上述 PCR 產(chǎn)物通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳，以 DNA 凝膠回收試劑盒回收純化。將 PCR 回收產(chǎn)物與 pET-30a(+)以NdeI 和EcoR I 雙酶切，回收后用 T4 DNA 連接酶連接，以 CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，在卡那霉素抗性平皿挑選陽性克隆。用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性克隆質(zhì)粒，對質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和雙酶切鑒定，將初步鑒定為陽性克隆的菌株測序。

1.2.4 Fl 蛋白的表達(dá)與純化 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pET-30a/F1 陽性克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，挑選高表達(dá)克隆。將誘導(dǎo)后菌液離心，取上清樣品 ⑴，將菌體沉淀重懸于 PBS，超聲碎菌，取樣品 ⑵，將破碎菌離心，取上清樣品 ⑶，將沉淀重懸于 8 mol/L 尿素溶液，溶解取樣 ⑷，進(jìn)行SDS-PAGE 分析重組蛋白的表達(dá)形式。將構(gòu)建菌株接種于 LB 培養(yǎng)基 37 ℃ 培養(yǎng)，用 IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，收獲物經(jīng)離子交換和疏水層析方法純化 F1 蛋白。

1.2.5 F1 蛋白的檢測與鑒定[7]SDS-PAGE 法測定其分子量。等電聚焦電泳法測定 F1 蛋白的等電點(diǎn)。用氨基酸測序儀測定 N 末端氨基酸序列。樣品經(jīng) SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，封閉，用鼠疫診斷血清和辣根過氧化物酶逐級標(biāo)記羊抗兔 IgG 抗體，鄰苯二胺（OPD）顯色，進(jìn)行 Western blot 分析。

2 結(jié)果

2.1 F1 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒 pET-30a/F1 的鑒定

圖 1 F1 基因 PCR 擴(kuò)增及 pET-30a/F1 質(zhì)粒雙酶切電泳圖Figure 1 Electrophoretic analysis of F1 PCR product and digested recombinant plasmid pET-30a/F1

PCR 擴(kuò)增目的基因片段經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳，在 500 bp 分子量處見一明顯電泳帶（圖 1A），與理論分子量一致。

以NdeI 和EcoR I 雙酶切重組質(zhì)粒 pET-30a/F1，可見一條 500 bp 的目的基因帶和一條5300 bp 大小的載體片段（圖 1B）。

陽性克隆由 Invitrogen 公司進(jìn)行 DNA 測序，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中 F1 抗原結(jié)構(gòu)基因序列與Gene-Bank（X61996）的基因序列完全相同。

2.2 重組蛋白的表達(dá)及純化

重組蛋白 F1 有 3 種表達(dá)形式：分泌于細(xì)胞外培養(yǎng)基中、細(xì)胞內(nèi)可溶形式以及細(xì)胞內(nèi)包涵體形式（圖 2）。經(jīng)分析，分泌表達(dá)于胞外培養(yǎng)基中的 F1蛋白可溶性好而且純度高，因此我們對該蛋白進(jìn)行純化。經(jīng)離子交換層析和疏水層析純化，F(xiàn)1 蛋白純度可達(dá) 95%（圖 3）。

圖 2 F1 抗原的表達(dá)形式電泳圖Figure 2 Expression form analysis of F1

圖 3 重組蛋白 F1 的純化電泳圖Figure 3 Analysis of F1 purified products

2.3 Fl 蛋白的檢測與鑒定

2.3.1 分子量測定結(jié)果 經(jīng) SDS-PAGE 電泳，根據(jù)薄層掃描的結(jié)果，F(xiàn)1 蛋白在 12% 分離膠的SDS-PAGE 中的表觀分子量在 15.6 kD 左右（圖4）。

圖 4 F1 蛋白 SDS-PAGE 法分子量分析結(jié)果Figure 4 Molecular weight analysis of F1 protein

2.3.2 等電點(diǎn)測定結(jié)果 等電聚焦電泳法測定F1 蛋白的等電點(diǎn)為 4.15，與理論等電點(diǎn) 4.3 接近。

2.3.3 N 末端氨基酸的測定結(jié)果 用氨基酸序列分析儀測定，其 N 末端 15 個(gè)氨基酸序列為ADLTASTTATATLVE，與理論序列一致。

2.3.4 蛋白質(zhì) Western blot 檢測 重組蛋白 F1經(jīng) SDS-PAGE 后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行 Western blot檢測。結(jié)果顯示重組蛋白與抗鼠疫桿菌血清有特異的印跡反應(yīng)(圖 5)。

圖 5 重組蛋白 F1 的免疫印跡分析Figure 5 Western blot of recombinant protein F1

3 討論

F1 結(jié)構(gòu)基因（caf1）受溫度調(diào)節(jié)，37 ℃ 時(shí)能產(chǎn)生 F1 抗原。結(jié)構(gòu)基因長度為 513 個(gè)單核苷酸，編碼一種分子量為 17.6 kD 的由 170 個(gè)氨基酸組成的多肽，其中包括 21 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。該信號(hào)肽與大腸桿菌信號(hào)肽有很高的同源性，在分泌到菌體表面時(shí)信號(hào)肽已被切除[8]。本研究通過對重組表達(dá)的 F1 蛋白 N 末端氨基酸測定表明，該信號(hào)肽可被大腸桿菌 BL21(DE3) 識(shí)別并切除，重組蛋白 F1 被分泌到細(xì)胞外。

F1 抗原為一位于鼠疫菌體表面莢膜物質(zhì)，表達(dá) F1 抗原的鼠疫菌對巨噬細(xì)胞有抗吞噬作用[9]。許多研究表明以 F1 抗原制備的亞單位疫苗可使動(dòng)物產(chǎn)生對鼠疫的保護(hù)作用，表明 F1 抗原是一種重要的保護(hù)性抗原[10-11]。世界上許多國家都在進(jìn)行以 F1 抗原為基礎(chǔ)的鼠疫亞單位疫苗研制，有些已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段[12]。

本實(shí)驗(yàn)通過基因重組技術(shù)在大腸桿菌 BL21(DE3) 中成功地表達(dá)了 F1 抗原。實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌表達(dá)的 F1 抗原有 3 種表達(dá)形式，分泌表達(dá)于細(xì)胞外可溶形式，細(xì)胞內(nèi)可溶形式以及細(xì)胞內(nèi)包涵體形式。分泌表達(dá)于細(xì)胞外的 F1 蛋白可溶性好而且純度高，避免了以包涵體形式存在的蛋白在純化過程中變性劑對蛋白免疫原性的破壞，有利于 F1 抗原的純化及抗原性保存。對純化后重組蛋白 F1 的分子量、等電點(diǎn)及 N 末端氨基酸序列進(jìn)行測定，結(jié)果與理論一致。免疫印跡結(jié)果也表明該 F1 抗原能與抗鼠疫診斷血清結(jié)合，說明重組的 F1 蛋白有良好的抗原性。本研究為新型鼠疫疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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Secreted expression and identification of F1 protein ofYersinia pestisin prokaryocyte

WEI Dong, WANG Guo-zhi

ObjectiveTo construct the recombinant plasmid expressing F1 protein ofYersinia pestisinE.coliBL21(DE3).

MethodsThe F1 gene was amplified by PCR, cloned into prokaryotic expression plasmid pET30a(+) and then transformed intoE.coliBL21(DE3).The recombinantE.coliBL21(DE3) was induced by IPTG.The protein was purified, and its molecular weight,isoelectric point and N-terminal amino acid sequence was identified.The antigenicity of the protein was measured by Western blot.

ResultsThe F1 protein is mainly expressed in a secreted form by the recombinantE.coliBL21(DE3) strain.Its molecular weight is 15.6 kD identified by SDS-PAGE, and isoelectric point is 4.15.The N-terminal amino acid sequence of the protein is completely the same as expected.As Western blot result shows, the F1 protein could react with plague anti-sera from rabbit.

Conclusion pET-30a/F1 expressing secretive F1 protein is successfully constructed.The F1 protein developed by this study has good immunoreactivity with plague anti-serum.

Yersinia pestis; Cloning, molecular; Gene expression

WANG Guo-zhi, Email: tbtestlab@vip.tom.com

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(3):202-205

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.008

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2006AA02Z461）

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院細(xì)菌一室

王國治，Email：tbtestlab@vip.tom.com

2012-02-13

Author Affiliation: National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

·綜述·