許言午 張江虹 張麗娜 韓志芬 金國琴 (上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 003)

硫化氫對(duì)D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響

許言午 張江虹1張麗娜 韓志芬2金國琴 (上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

目的觀察硫化氫對(duì)D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響。方法雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、D-半乳糖組、硫化氫6.25μmol/kg組(H2S-1)，硫化氫12.5μmol/kg(H2S-2)組，每組10只。D-半乳糖組每日腹腔注射D-半乳糖400 mg·kg-1·d-1，連續(xù)60 d;對(duì)照組每日腹腔注射等體積生理鹽水;硫化氫組處理同D-半乳糖組，同時(shí)分別按6.25和12.5μmol/kg腹腔注射硫化氫。采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;采用Western印跡檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平并測(cè)定組織Caspase-3相對(duì)活性。結(jié)果與對(duì)照組相比，D-半乳糖組大鼠心肌組織SOD活性下降、MDA含量升高，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Caspase-3相對(duì)活性升高;給予硫化氫能顯著改善D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平，減少細(xì)胞凋亡。結(jié)論硫化氫可通過提高抗氧化能力和減少細(xì)胞凋亡緩解D-半乳糖所致心肌組織損傷。

硫化氫;心肌損傷;氧化應(yīng)激;細(xì)胞凋亡;D-半乳糖

硫化氫(H2S)是近年發(fā)現(xiàn)的繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，在心血管系統(tǒng)發(fā)揮著重要的病理、生理作用〔1，2〕。大量的研究表明，H2S可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡和減少氧化應(yīng)激而減輕由缺血-再灌注或缺氧引起的急性心肌損傷〔3～5〕。本研究以D-半乳糖亞急性損傷大鼠為模型，觀察H2S對(duì)亞急性中毒引起的心肌組織氧化應(yīng)激和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，2月齡，體重(250±10)g。由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2007-0005〕。

1.2 試劑 硫氫化鈉 (NaHS):Sigma公司;D-半乳糖:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 (Cat.No.63004434);超氧化物歧化酶 (SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛 (MDA)測(cè)定試劑盒、蛋白定量Bradford試劑盒:南京建成生物工程研究所;Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒:BioVision公司 (Cat.No.K106-100);兔抗大鼠 Bcl-2抗體、Bax抗體:Cell Signalling公司:(Cat.No.2870，Cat.No.2772);兔抗大鼠 β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體:Abmart公司 (Cat.No.P30002，Cat.No.M21003);親水蛋白分離試劑盒:普利萊基因技術(shù)有限公司 (Cat.No.P1250);BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒及超敏ECL試劑盒:Pierce公司 (Cat.No.23225)。其他常用試劑均為分析純:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器 組織超聲破碎儀(美國Misonix公司);酶聯(lián)免疫測(cè)定儀(美國MD公司);蛋白質(zhì)電泳、半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);G:BOX凝膠分析系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 40只大鼠，隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、D-半乳 糖組、H2S-1(6.25 μmol/kg)組 和 H2S-2(12.5μmol/kg)組，每組10只。溫度18℃ ～22℃，光暗周期12 h∶12 h，群養(yǎng)，5 只/籠，常規(guī)喂養(yǎng)飼料，自由飲水。D-半乳糖組每日腹腔注射D-半乳糖400mg·kg-1·d-1，連續(xù)60 d;對(duì)照組每日腹腔注射等量生理鹽水;H2S-1組和H2S-2組處理D-半乳糖組，同時(shí)以NaHS為供體溶解于生理鹽水，每日分別按6.25μmol/kg和12.5μmol/kg腹腔注射H2S。

1.4.2 組織取材 大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，400 mg/kg)，腹主動(dòng)脈取血處死;取下心肌組織，生理鹽水洗凈，立即測(cè)定或分置于Eppendorf管中-70℃保存。

1.4.3 大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量檢測(cè) 取左心室心肌組織，按100 mg/ml生理鹽水加入生理鹽水。于冰水浴中小彎剪剪碎，超聲破碎，使其充分裂解，4℃離心10 min后取上清，BCA法測(cè)定蛋白含量。其余操作按試劑盒說明書進(jìn)行，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行蛋白含量校正。

1.4.4 大鼠心肌組織凋亡檢測(cè)

1.4.4.1 Western印跡檢測(cè)大鼠心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 取左心室心肌組織，按100 mg/ml加入裂解液，裂解操作同1.4.3，后于4℃離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白含量。然后進(jìn)行電泳及Western印跡分析，其中蛋白上樣量調(diào)整為80 μg，一抗稀釋度為 1∶2 000，二抗稀釋度為1∶5 000。Western印跡結(jié)果采用Genesnap進(jìn)行圖像采集，Image pro6.0分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行密度掃描，得出條帶密度值，以β-actin為內(nèi)參照。

1.4.4.2 大鼠心肌組織Caspase-3相對(duì)活性測(cè)定 取大鼠左心室心肌組織50 mg，以100 mg/ml加入試劑盒提供的裂解液，制備組織勻漿，4℃離心5 min，取上清，以Bradford法進(jìn)行蛋白定量。用稀釋液調(diào)整上清蛋白含量為2 mg/ml，其余按試劑盒說明書進(jìn)行。以對(duì)照組活性為1，計(jì)算Caspase-3相對(duì)活性。

2 結(jié)果

2.1 硫化氫對(duì)D-半乳糖處理大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的影響 見表1。

2.2 硫化氫對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達(dá)及Caspase-3相對(duì)活性的影響 見表2，圖1。

表1 硫化氫對(duì)D-半乳糖處理大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

表1 硫化氫對(duì)D-半乳糖處理大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與D-半乳糖組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

組別 SOD活性(U/mg) MDA含量(nmol/mg)對(duì)照組 49.8±3.64) 2.14±0.374)H2 S-1組 41.2±3.72)3) 3.28±0.762)3)H2 S-2組 45.1±4.52)4) 2.72±0.361)4)D-半乳糖組 37.1±2.52) 3.85±0.562)

表2 硫化氫對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)和Caspase-3相對(duì)活性的影響(±s，n=10)

表2 硫化氫對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)和Caspase-3相對(duì)活性的影響(±s，n=10)

組別Bcl-2 Bax Caspase-3對(duì)照組 1.00±0.004) 1.00±0.004) 1.00±0.274)H2 S-1組 0.65±0.132)3) 1.52±0.132)4) 2.54±0.332)4)H2 S-2組 0.71±0.142)4) 1.18±0.131)4) 1.76±0.292)4)D-半乳糖組 0.37±0.112) 2.12±0.352) 3.04±0.552)

圖1 各組Bcl-2、Bax W estern印跡檢測(cè)

3 討論

D-半乳糖引起的亞急性中毒模型是目前被廣為使用的擬衰老模型。雖然其作用機(jī)制尚未完全明確，但根據(jù)衰老的代謝學(xué)說，D-半乳糖引起的糖代謝紊亂必然會(huì)導(dǎo)致心、肝、腎、腦等重要器官代謝異常，最終出現(xiàn)衰老〔6〕。同時(shí)，大量的研究顯示，D-半乳糖可通過代謝過程中產(chǎn)生的自由基引起氧化應(yīng)激損傷〔7～9〕和細(xì)胞凋亡〔10，11〕。

長(zhǎng)期以來，H2S一直被認(rèn)為是污染環(huán)境的毒性氣體，是造成大氣和水以及某些職業(yè)病的主要危害物質(zhì)之一。超過生理劑量的H2S對(duì)活體器官的毒性主要體現(xiàn)在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及對(duì)呼吸系統(tǒng)的抑制作用。然而，近年研究表明H2S不但在體內(nèi)可以內(nèi)源性生成〔12〕，而且在心血管系統(tǒng)發(fā)揮著重要的病理生理作用，被確定為繼NO和CO之后的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子〔2〕。大量的研究表明，H2S預(yù)處理和后處理可以通過減少氧化應(yīng)激損傷、抑制心肌細(xì)胞凋亡等機(jī)制有效減輕缺血-再灌注或缺氧引起的急性心肌損傷〔3～5〕。那么，H2S對(duì)亞急性和慢性損傷引起的心肌氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用如何未見報(bào)道。本文結(jié)果說明，外源性給予H2S可通過增強(qiáng)SOD活性，降低MDA含量而減輕D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)可以通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達(dá)、降低Caspase-3的活性而減輕心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。然而H2S對(duì)上述指標(biāo)作用的具體通路機(jī)制和內(nèi)源性H2S/CSE系統(tǒng)在心肌組織衰老等慢性變化中的作用和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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R285.5

A

1005-9202(2012)16-3471-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.057

上海市自然科學(xué)基金(10ZR1430000，09ZR1403600);上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項(xiàng)基金(szy08007);上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50301)資助

1 復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心

許言午(1974-)，男，博士，講師，主要從事中醫(yī)藥對(duì)老年病防治的研究。

〔2011-11-09收稿 2012-01-10修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)