馬 莉 (沈陽醫(yī)學(xué)院附屬奉天醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110024)

胰島素樣生長(zhǎng)因子1對(duì)局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

馬 莉 (沈陽醫(yī)學(xué)院附屬奉天醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110024)

目的觀察胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法采用線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，動(dòng)物隨機(jī)分成胰島素樣生長(zhǎng)因子-1組(IGF-1組)和對(duì)照組(control組)。對(duì)兩組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，采用TUNEL染色計(jì)數(shù)腦缺血周邊區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)，免疫組織化學(xué)方法觀察BCL-2、Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果IGF-1組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于control組，缺血周邊區(qū)的凋亡細(xì)胞明顯少于control組;但BCL-2蛋白免疫陽性細(xì)胞明顯多于control組，Bax蛋白免疫陽性細(xì)胞明顯少于control組。結(jié)論IGF-1可增加腦缺血之后缺血周邊區(qū)BCL-2蛋白的表達(dá)，減少Bax蛋白表達(dá)，拮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能。

胰島素樣生長(zhǎng)因子1;神經(jīng)細(xì)胞凋亡;糖尿病;腦缺血

凋亡是腦梗死的重要病理環(huán)節(jié)，是影響患者恢復(fù)和預(yù)后的主要因素。采取相應(yīng)措施抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，有可能阻止腦梗死缺血瀑布損傷的擴(kuò)展，防止梗死的擴(kuò)大，有利于患者神經(jīng)功能的恢復(fù)。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，由70個(gè)氨基酸組成的多肽，在神經(jīng)組織的生長(zhǎng)、分化、修復(fù)、再生中具有重要的作用，可能對(duì)腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡有重要作用，近年來倍受關(guān)注〔1～3〕。實(shí)驗(yàn)擬觀察經(jīng)過IGF-1干預(yù)之后，局灶性腦缺大鼠的神經(jīng)功能和缺血周邊區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)及BCL-2、Bax蛋白表達(dá)的變化，了解IGF-1干預(yù)腦缺血時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥片和試劑 IGF-1購(gòu)自Santa Cruz公司，TUNEL試劑盒購(gòu)于Roche公司，一抗為鼠抗人Bax及Bcl-2單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，四氧嘧啶購(gòu)于sigma公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只Wistar大鼠，雌雄不限，200～250 g，SFP級(jí)別，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及干預(yù) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成IGF-1組和對(duì)照組，每組20只。IGF-1組造模后每日頸部皮下注射 IGF-1 10μg/kg，對(duì)照組不造模只注射等量的生理鹽水。

1.2.2 模型的制備 參照文獻(xiàn)〔4〕方法，采用經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)致局灶性永久性腦缺血模型。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%戊巴比妥鈉(0.05 g/kg體重)腹腔注射麻醉，仰臥位固定。頸部左側(cè)正中切口，分離胸鎖乳突肌，切斷二腹肌前腹，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA)，將線栓從右側(cè)ECA殘端插入ICA;輕輕牽拉ECA殘端，使其與ICA成一條直線，調(diào)整線栓角度，使改良線栓弧度水平向外，與頸前正中線呈45°水平向外的夾角，移去夾閉ICA的蛙心夾，輕輕將線栓送入顱內(nèi)。實(shí)驗(yàn)期間自由飲食、飲水，注意通風(fēng)、干燥和清潔，保持安靜。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 采用文獻(xiàn)〔5〕中的神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(NSS)分別于術(shù)后7、14 d對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分范圍0～18分，分?jǐn)?shù)越高表明大鼠的神經(jīng)功能缺損越重。

1.2.4 細(xì)胞凋亡過氧化物酶標(biāo)記測(cè)定試劑盒(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 石蠟切片按照TUNEL試劑盒說明書操作，進(jìn)行細(xì)胞凋亡染色。連續(xù)冠狀切片，片厚4μm。每個(gè)標(biāo)本取兩張切片，光鏡(400倍)下觀察凋亡細(xì)胞，任意選不重疊的5個(gè)高倍視野，取平均值。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 免疫組織化檢測(cè) 各組于術(shù)后7、14 d分別取10只大鼠，用10%水合氯醛麻醉，先后用肝素化生理鹽水及4%多聚甲醛心內(nèi)灌注，迅速斷頭取腦，以前囟為中心、冠狀面±1 mm切取腦片，置于4%多聚甲醛中后固定24 h，石蠟包埋，每隔100μm連續(xù)作6μm厚腦冠狀面石蠟切片。石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Bcl-2、Bax含量，具體步驟按照即用型SABC免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果 IGF-1組7、14 d時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于對(duì)照組，有顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.2 TUNEL檢測(cè)結(jié)果 IGF-1組7 d和14 d有凋亡細(xì)胞存在，分別為53.41±3.76和38.93±3.22;對(duì)照組7 d和14 d凋亡細(xì)胞分別為92.42±4.60和119.36±4.54，對(duì)照組要多于IGF-1組(P＜0.01)，IGF-1組14 d少于7 d。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 Bcl-2:兩組大鼠在腦缺血周邊區(qū)均有Bcl-2蛋白免疫陽性細(xì)胞，形態(tài)各異，有橢圓形細(xì)胞、球形細(xì)胞、梭形細(xì)胞等，但I(xiàn)GF-1組明顯高于對(duì)照組，IGF-1組14 d多于7 d。見圖1。Bax蛋白免疫陽性細(xì)胞的存在與BCL-2形態(tài)相近，但I(xiàn)GF-1組顯著低于對(duì)照組。見圖2。

表1 兩組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較(±s，n=10)

表1 兩組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較(±s，n=10)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05

組別7.29±0.46 5.48±0.63 IGF-1組 5.75±0.841) 4.02±0.721)7 d 14 d對(duì)照組

圖1 兩組Bcl-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×100)

圖2 兩組Bax免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×100)

3 討論

生長(zhǎng)因子是一個(gè)大家族，IGF-1只是其中的一種。IGF-l系大腦發(fā)育所必需，且在腦缺血或(和)缺氧后再灌注等多種病理狀態(tài)下對(duì)機(jī)體發(fā)揮重要的保護(hù)作用。IGF-1及其受體在正常腦組織有少量表達(dá)，腦缺血發(fā)生后，腦組織IGF-1含量明顯增加，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布也發(fā)生相應(yīng)改變〔6〕。神經(jīng)功能缺損評(píng)定是一個(gè)重要的判定腦保護(hù)的指標(biāo)，它是對(duì)神經(jīng)功能的一個(gè)綜合評(píng)價(jià)，是在動(dòng)物個(gè)體的水平上對(duì)其運(yùn)動(dòng)功能、感覺功能及認(rèn)知功能的定量評(píng)價(jià)，也是判定治療是否有效的最根本和最重要的標(biāo)準(zhǔn)，只有神經(jīng)功能缺損評(píng)分好轉(zhuǎn)，才能說明治療在臨床上可以改善癥狀，對(duì)于患者的預(yù)后有幫助〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示7、14 d IGF-l治療后神經(jīng)功能評(píng)分均明顯低于對(duì)照組，說明應(yīng)用IGF-l能夠改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，具有腦保護(hù)作用，而且14 d時(shí)要好于7 d，由于時(shí)間和條件限制，實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的觀察，但有實(shí)驗(yàn)報(bào)道IGF-l的作用與應(yīng)用時(shí)間呈正相關(guān)〔8〕。

TUNEL是目前國(guó)際上確定細(xì)胞凋亡的一種免疫組織化學(xué)染色方法，陽性細(xì)胞是正處于凋亡過程之中〔9〕。細(xì)胞凋亡是許多基因參與的程序化過程，有著非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，其中，Bcl-2基因家族是目前較為公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)bcl-2基因具有抗凋亡作用，應(yīng)用bcl-2基因治療大鼠局灶性腦缺血可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少梗死灶體積，改善大鼠神經(jīng)功能〔10〕。已知Bax是Bcl-2的同種性蛋白，二者之間的比例決定了細(xì)胞是生存還是凋亡，Bax高表達(dá)時(shí)，使細(xì)胞趨于凋亡，而當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時(shí)，對(duì)細(xì)胞凋亡則起抑制作用。兩項(xiàng)因子的作用呈相反的作用趨勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IGF-1注射后凋亡細(xì)胞明顯減少，且14 d時(shí)比7 d時(shí)要少，而BCL-2蛋白的表達(dá)增多，14 d明顯多于7 d，但Bax蛋白的表達(dá)減少，IGF-1組明顯少于對(duì)照組，但7 d和14 d沒有顯著差別?？傊?，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了IGF-1可以顯著降低腦神經(jīng)功能評(píng)分及減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而具有改善腦缺血性損傷的作用。

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R74

A

1005-9202(2012)16-3469-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.056

遼寧省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010-01)

馬 莉(1969-)，女，主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病的臨床診治研究。

〔2012-01-06收稿 2012-03-20修回〕

(編輯 袁左鳴)